药品无菌检查法——培养基灵敏度检查法

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培养基的灵敏度测试

培养基的灵敏度测试培养基的灵敏度测试是其质量控制的一个重要检测部分。

方法如下：1.用于菌数计数的半固体琼脂培养基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。

取预先制备好的琼脂培养基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培养基平皿3~5个（如较著名的如MERCK，DIFICOL产品）做对照试验，待培养基表面的菌液被琼脂培养基吸干或风干后，将培养皿倒置于培养箱的使用温度下培养48~72小时，（也可采用浇碟法进行）取出培养后的平皿点计菌落数。

样品培养基上的微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%。

否则，需重新检查，或该培养基被视为不符合促生长要求。

2.用于控制菌检查的富集培养基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查。

每100ml培养基内分别接入试验菌小于100cfu，每个菌种接种两瓶培养基，将接过种的培养基置于指定条件下培养。

应在16~18小时后可明显观察到培养基内有微生物生长，则证明此培养基合格。

原则上无论是采用脱水培养基还是按相关处方配制的培养基，一旦制成成品培养基，则应对每个配制批号培养基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培养基的质量。

按脱水培养基的生产批号做灵敏度检查是基于培养基的灭菌程序已经经过验证。

如果实验室使用的是商购的成品培养基，供应商应随培养基提供相应批次的培养基质量检测报告，报告包括培养基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。

建议在使用某一新的成品培养基（新供应商或新培养基品种）时，应至少考察三个不同批次的培养基质量，只有三批质量均合格方可使用该培养基。

微生物限度检查用成品培养基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以复核其质量。

用于无菌检查试验的每批培养基，均必须按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于实验室自行配制的培养基。

2010版无菌检查法

2010版药典无菌检查法的主要增修订情况
黑龙江省食品药品检验检测所
杨利红
增、修订涉及范围

前言部分培养基部分灵敏度检查稀释液、冲洗液方法验证薄膜过滤法培养及观察结果判断表1、表2和表3

前言部分
1、新增规定：“ 防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。” 2、新增规定：“ 日常检验还需要对环境进行监控。” 3、新增规定：“ 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
供试品的无菌检查部分
薄膜过滤法
·5、增、修订：装有药物的注射器供试
品的检验方法删除 “装上无菌针头（非包装中所配带的）” 修订为 “取规定量，排出注射器中的内容物，若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，直接过滤”
供试品的无菌检查部分
直接接种法
·原直接接种法中删除ß-内酰胺类或
磺胺类供试品

增加表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法
表1 常见干扰物的中和剂或灭活方法
干扰物
戊二醛酚类、乙醇、吸附物醛类季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯汞类制剂双胍类化合物碘酒、洗必泰类卤化物乙二胺四乙酸（EDTA）磺胺类 ß-内酰胺类抗生素
可选用的中和剂或灭活方法
亚硫酸氢纳稀释法稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐卵磷脂、聚山梨酯

培养基部分
1、删除：1. 硫乙醇酸盐流体培养基后括号（用于培养好氧菌、厌氧菌）的说明 2、删除：2. 改良马丁培养基后括号（用于培养真菌）的说明

3、删除：3. 选择性培养基项下 “ 如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山梨酯80 （用于非水溶性供试品）或β -内酰胺酶（用于β -内酰胺类供试品）”等说明。修订为：在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。

无菌检查法

修订为：“ 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量”。——明确液体制剂最少检验量见表2的第2列，供试品最少检验数量见表2的第3列。 · 修订了表2下的注: ——对供试品容器装量不够接种两种培养基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。
表3
• 将表3原名称：“上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量”
的必检项目，为对所检供试品的质量负责，对检验质量的负责，应对检出菌有一定的证明。
● 理由（3）全国微生物重点实验室的建立和发展，
以及现有微生物检定能力的证明，是药典增加检出菌检定规定的基础建设和技术支撑。
相信随着科技的进步、国家对药品安全的关注，和我们对无菌检查法的深入研究及微生物检定能力的发展，药典无菌检查法中增加对检出菌的检定要求是必须的，也是能够做到的！！
——美国药典中同时收载两种巯乙醇酸盐流体培养基供选择，其中之一无刃天青和琼脂。
引入思考：什么情况下应选择用？为甚我国只收载一种？
理由（4）可能存在严格厌氧菌——巯乙醇酸盐
流体培养基中所营造的厌氧环境是否足以满足严格厌氧菌的培养需要。
引入思考：现无菌检查的实验操作、培养条件是否满足严格厌氧菌的检出。
轮船正招式成商立局，标志着中国新式航运业的诞生。
(2)1900年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是
在列强排挤中艰难求生。
2．航空
(1)起步：1918年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始
研制。
(2)发展水：上1飞918机年，北洋政府在交通部下设“
”；此后十年间，航空事业获得较快发展。
供试品的无菌检查部分
薄膜过滤法
·5、增、修订：装有药物的注射器供试
品的检验方法 ——删除 “装上无菌针头（非包装中

无菌检查法

无菌检查法1.目的：建立对成品无菌检查的标准操作规程。

2.范围：对成品的无菌检查。

3.责任：质量监督部。

4.内容：4.1概述：无菌检查是检查药品与敷料是否染有活菌的一种方法。

无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，同时也应避免在有抑菌条件下操作。

4.2仪器、设备和用具：℃及除湿装置。

缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。

℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。

无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。

℃的生化培养箱。

4.2.3离心机、显微镜、高压消毒炉、标准pH比色器（0.02酚红指示剂和溴钾酚蓝指示剂）、恒温烤箱。

℃灭菌30分钟。

4.2.4.1移管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞入少许棉花，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，盖严，消毒备用。

±0.5）℃蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应置恒温培养箱中烘干。

适于高温灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。

4.3试液：4.3.175％乙醇溶液配制酒精棉球用。

4.3.2碘酊溶液配制碘酒棉球用。

4.3.3灭菌生理盐水0.9％氯化钠溶液，分装于试管或三角瓶中，瓶口用棉塞或海棉胶专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。

4.3.4新洁尔尔灭（1:1000）溶液。

4.3.53-5％甲酚溶液。

4.3.60.02％酚红指示剂pH6.8-8.4系列比色液管。

药品无菌检查

洁净室不是绝对无菌的。
概念不等于无菌室（命名需准确）
洁净实验室
ISO14644---按悬浮粒子大小划分了洁净室的级别（等级1-9级）
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洁净实验室
洁净实验室
各国不同法规对于洁净室污染控制的要求对比美国联邦标准FED-STD-209E：率先建立了由悬浮粒子含量规定空气洁净度的分级标准，以每立方英尺空气所含最大允许微粒的数量确定，分为1、10、100、1000、10000、100000六个级别。国际标准ISO14644-1：空气洁净度分为9个级别，比美国联邦标准多出3个。美国FDA《无菌工艺药品CGMP工业指南》：以动态期间在物料漏置临近处所测数据为依据，强调了动态概念，对微生物进行了控制，100、1000、10000、100000对应ISO5、6、7、8 美国药典《1116》：根据美国联邦标准改编，M1-M7 欧盟GMP：A、B、C、D，静态、动态监测、强调了粒子的在线监测 2010年版GMP:等同于欧盟
药品无菌检查法
检验数量：一次试验所用供试品最小包装容器的数量
出厂产品按表1，上市产品监督检验按表2
最少检验数量不包括阳性对照用的。
检验量：按表3，采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。
供试品的无菌检查
药品无菌检查法
药品无菌检查法
2015年版药典的变化
方法适用性实验：
2015年版药典的变化
菌种的培养条件改变
无菌检查实验条件
和以前的100级、10000级的区别？需要怎么控制环境？
由“万级下的局部百级”修订为“B+A”
2015年版药典的变化
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培养基灵敏度及适用性检查操作规程

1. 目的：通过培养基适用性检查，确保购买的培养基符合实验要求。

2. 范围：本规程适用于技术质量部实验员对培养基适用性的检查。

3. 职责：质量部实验员负责执行此规程。

4. 内容：4.1 检验依据：《中华人民共和国药典》2015版4.2 试验用具：烧杯、三角瓶、酒精灯、接种环、平皿、试管、吸管、移液枪、滴管、电子天平、电热恒温培养箱、生化培养箱或恒温恒湿培养箱、单人净化工作台、高压蒸汽灭菌器、微生物限度仪、漩涡混合器、试验菌种、检查用培养基等。

4.3 无菌培养基适用性检查：本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

4.3.1 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基（培养基的配制按《培养基配制操作规程》配制）。

4.3.2 稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

a) 0.1%无菌蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。

b) pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，无水磷酸氢二钠5.77g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

c) 根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液（如0.9%无菌氯化钠溶液）。

如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

4.3.3 无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。

4.3.4 灵敏度检查4.3.4.1 菌种培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）〔CMCC（B）10 104〕枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F）98 001〕黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98 003〕4.3.4.2 菌液制备a) 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；b) 接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养24～48小时，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

无菌检查方法验证表和检查记录表

无菌方法验证品名：规格：批号：检查时间：1.培养基：硫乙醇酸盐流体培养基，批号：由：提供；营养肉汤，批号：由：提供；改良马丁培养基批号：由：提供。

2.验证试验用菌种：(1) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26003]；(2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]；(3) 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]；(4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [CMCC(B) 10104](5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]；(6) 白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98001]；(7) 黑曲霉菌(Aspergillus niger) [CMCC(F)98003]。

3. 仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，STV3封闭式/开放式无菌检查薄膜过滤器，浙江宁海白石药检仪器厂。

4.方法：中国药典2005版二部附录。

5.操作方法：5.1 菌液制备：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, ℃培养小时。

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌肉汤培养物，加生理盐水，10倍递增稀释至约10-5~10-8之间，其中金黄色葡萄球菌取稀释级，铜绿假单孢菌取稀释级，大肠埃希菌取稀释级，枯草芽孢杆菌取稀释级，生孢梭菌取稀释级。

白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中, ℃培养小时。

再取白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取加生理盐水，10倍递增稀释至，取加生理盐水，混匀备用。

将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁培养基上，℃培养，使大量的孢子成熟。

2010年版药典无菌检查法

2010版药典附录ⅪH 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在环境洁净度10,000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。

培养基培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2℃～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

1.硫乙醇酸盐流体培养基酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液 1.0 ml硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g(或硫乙醇酸) （0.3 ml) 水1000 ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

硫乙醇酸盐流体培养基置30℃～35℃培养。

无菌检查法-2010版中国药典

附录Ⅻ A 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在环境洁净度10 000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。

培养基培养基的制备培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2℃～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

1. 硫乙醇酸盐流体培养基酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液 1.0 ml硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g(或硫乙醇酸) （0.3 ml) 水1000 ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1 ±0.2 。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2 ，灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5 ，否则，须经100 ℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

2.改良马丁培养基胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g 水1000 ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 值约为6.8 ，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH 值使灭菌后为6.4 ±0.2 ，分装，灭菌。

无菌检查法包括

无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。

前者适用于非抗菌作用的供试品，后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。

操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外包装浸没或擦拭消毒后，以无菌的方法取内容物。

凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。

1. 直接接种法(1) 供试品准备供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液，按表1或表2规定量取供试品，混合。

供试品如为注射用无菌粉末或无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料，按表1或表2规定量取供试品，加入无菌水或0.9％无菌氯化钠溶液,或该药品项下规定的溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液。

供试品如为外科敷料，取供试品4个包装,以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪取约100m g或1cm×3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最小包装5个，拆开包装，共取11 股，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。

供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。

或用0.9％无菌氯化钠溶液各40ml，分别冲洗内壁（输血、输液袋）收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查。

供试品如为青霉素类药品，按表1或表3规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合。

亦可按薄膜过滤法检查。

供试品如为放射性药品，取供试品1瓶（支），接种于装量为7.5ml的培养基中。

每管接种量为0.2ml。

2.操作取上述备妥的供试品,以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml，作阳性对照,另接种于真菌培养基5管。

轻轻摇动,使供试品与培养基混合。

需气菌、厌气菌培养基管置30～35℃、真菌培养基管置20～25℃培养7日。

在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。

阳性对照管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后,不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。

无菌检查法(逐字对比20版药典变化)

无菌检查法，逐字对比20版药典变化无菌检查的定义及无菌检查的适用条件无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供拭品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。

培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基商品化的预制培养基。

胰酪胨 1.50g氯化钠 2.5g酵母浸出粉 5.0g葡萄糖/无水葡萄糖 5.5g/5.0g新配制的0.1% 刃天青溶液 1.0mlL-胱氨酸0.5g琼脂 0.75g硫乙醇酸钠 0.5g水 1000ml(或硫乙醇酸）（0.3ml）除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节PH为弱碱性，煮沸，滤清，加人葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节PH, 使灭菌后在25℃的PH值为7.1土0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

2、胰酪大豆胨液体培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化3、中和或灭活用培养基按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌前或使用前加人适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。

4、0.5 %葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生素的无菌检查）▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化5、胰酪大豆胨琼脂培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化6、沙氏葡萄糖液体培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化7、沙氏葡萄糖琼脂培养基▲该项目下2020版药典四部通则与2015版药典四部通则内容无变化培养基的适用性检查无菌性检查每批培养基一般随机取不少5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。

无菌检查用培养基灵敏度检查标准操作规程

黑曲霉( Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕
4.4菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18小时～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23～28℃培养24～48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。
4.5培养基接种
取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。
4.2培养基
硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂斜面培养基。
4.3菌种
培养基灵敏度检查所用代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕

(完整版)无菌检查法-药典2010第三部-附录XIIA

附录XII A 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

日常检验还需对试验环境进行监控。

无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。

培养基培养基的制备：培养基按以下处方制备，亦可用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。

1、硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0mL硫乙醇酸钠0.5g （或硫乙醇酸0.3mL）琼脂0.75g 水1000mL除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入水葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经1000℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

2、改良马丁培养基胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g葡萄糖20.0g 水1000mL除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入putaotang 溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。

无菌检查

• 量取5%新洁尔灭20ml，加水稀释至约 1000ml，摇匀，即得。
• 培养基灵敏度检查：
• 新购的干燥培养基或采用不同牌号原材料的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。
• (1)取藤黄微球菌[Micrococcus luteus CMCC （B） 28001］的营养琼脂斜面和白色念珠菌 [Candida albicans CMCC（F）98001］的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；取生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]不含琼脂的需气、厌气培养基新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，沉淀菌体用0.9% 无菌氯化钠溶液制成均匀菌悬液。然后以10倍系列稀释后，制成1ml中含10-100个菌并计数。
• 薄膜过滤法：
• 将微孔滤膜过滤装置、抽滤瓶、排气管与真空泵相连，真空泵可置无菌室外。
• 取规定量供试品，按规定的方法处理后，加入 0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，混合后，通过装有孔径不大于0.45μm 的薄膜过滤器，减压抽干后，用0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次，每次至少 100ml，取出滤膜分成3等份，分别加入上述二种培养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml（抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌）。阳性对照管细菌应在培养24-48小时，真菌应在培养24-72小时有菌生长。
• 无菌室应每周和每次操作前用0.1％新洁尔灭或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外光灯杀菌1小时。在每次操作完毕，同样用2％甲酚或0.1％新洁尔灭溶液擦拭工作台面，用紫外光灯杀菌半小时。

无菌检查法药品无菌检查规程

无菌检查法药品无菌检查规程一、目的：阐述无菌检查规程。

二、适用范围：适用于无菌检查规程。

三、责任者：品控部。

四、正文：1 概述无菌检查是检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于中国兽药典要求无菌检查的其它品种是否染有活菌的一种方法。

无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作。

该检查法根据供试品有无抑菌作用而采用薄膜过滤法或直接接种法两种方式。

2 仪器、设备和用具无菌室分无菌操作室和缓冲间。

在缓冲间应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等。

无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温控(25±2)℃及除湿装置。

缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外灯和照明灯，操作室或工作台应保持正压。

2.1.1 无菌室应每周和每次操作前用%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外灯杀菌半小时。

在每次操作完毕，同样上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。

2.1.2 无菌室的无菌程度检查无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数；取直径约90mm双碟，在接种室内点燃乙醇灯，在乙醇灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板，在30～35℃培养48小时，取出检查，100级清洁度要求:3个平板上生长的菌落数平均不得超过1个。

无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级(一般用尘埃粒子计数仪)检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过个/升；空气流量应控制在～S；细菌菌落数平均＜1个，可根据无菌状况必要时置换过滤器。

恒温培养箱及可调20～25℃的生化培养箱。

离心机、显微镜、蒸汽灭菌器、标准PH比色器%酚磺酞指示液和溴钾酚蓝指示液)、恒温烤箱。

玻璃器皿试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管(1、5、10ml)、注射器(2、5、10ml)、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。

简述《中国药典》2010年版无菌检验方法

简述《中国药典》2010年版无菌检验方法【摘要】无菌检查法系用于检查《中国药典》要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

提高药品质量可控、有效、安全的技术保障。

【关键词】《中国药典》2010年版；无菌检验方法1 无菌检查的要求无菌检查应在环境洁净度10000级下，局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作。

为了保证无菌检查所用洁净区环境的稳定性，保证检验结果的可靠性，对洁净区的环境质量采用合理的控制措施和评价方法。

应定期按《医药工业洁净（室）区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

每次实验前要用适宜的消毒液清洁工作台面，地板，传递窗等，开启空气过滤器、紫外灯照射1小时。

每次实验结束后应先用湿抹布或拖布清理污迹，再用消毒液清洁台面及地面和传递窗等，清洁消毒程序是从内向外，从高洁净区到低洁净区，开启紫外灯照射30分钟。

2 菌种及菌液制备2.1 菌种名称金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代，其转种的培养物为第一代），以保证试验菌株的生物特性。

2.2 菌种及菌液制备①液体培养物直接稀释法：取试验菌的新鲜培养物少许接种于9-10ml的液体培养基中，按要求的温度和时间培养后作为原液。

取原液1ml用适宜的稀释剂做10倍系列稀释至每1ml含菌数50-100cfu（菌落形成单位）。

采用平皿计数法测定活菌数。

②细菌标准浓度比浊法：取试验菌的新鲜培养物少许接种于琼脂培养基或液体培养基中，按要求的温度和时间培养后备用。

取琼脂培养基上的培养物于适宜的稀释剂中制成均匀的菌悬液；液体培养物一般要比标准比浊管的浓度稀，同时培养基的颜色也影响比浊的结果，所以可采取离心集菌，去掉上清液，底部培养物再用适宜的稀释剂制成均匀的菌悬液，将上述菌悬液稀释至与标准比浊管（由国家药品检定机构分发）相同之浓度，此时的菌悬液作为原液。

无菌检查标准操作规程

无菌检查标准操作规程无菌检查法是检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及要求无菌的其他物品是否染有活菌的一种方法。

事实上，若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现细菌和真菌污染。

无菌检查法有薄膜过滤法、直接接种法两种方式。

细菌培养温度32.5℃±2.5℃，真菌培养温度25.5℃±2.5℃。

1 无菌检查的环境无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，操作环境的无菌保证程度将直接影响无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可考性，对洁净室（区）的环境质量采取合理的控制措施和评价方法是必要的。

无菌检查应在环境洁净度10000级和局部洁净度100级的单向留空气区域内或隔离系统中进行，其全过程笔削严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

无菌室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。

面积一般不超过10m2，不小于5m2；高度不超过2.4m。

由1～2个缓冲间、操作间组成（操作间和缓冲间的门不应直对），操作间与缓冲间之间应具备灭菌功能的样品传递箱。

在缓冲间内应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物；无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。

墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。

操作间内不应安装下水道。

无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，操作区洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温度控制18～26℃，相对湿度45%～65%。

缓冲间及操作室内均应设置能达到空气消毒效果的紫外灯或其他适宜的消毒装置，空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差应大于5Pa，洁净室（区）与室外大气的静压差大于10Pa。

无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300lx。