聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

分为变性胶与非变性胶两种，区别在于前者中含有一定浓度的变性剂（尿素、甲酰胺或两者合用）。其基本原理是单体丙烯酰胺在过硫酸铵与TEMED(N,N,N’N’-四甲基乙二胺)的催化与诱导下聚合成长链，当有N,N’-亚甲双丙烯酰胺参与聚合反应时，长链与长链之间就交联成凝胶，其孔径由链长与交联度决定，当DNA分子进入凝胶，在电场下进行泳动时，可根据各自迁移率的不同而得以分离。非变性胶可用于双链DNA分子的分离与纯化，变性胶可用于单链DNA分子的分离与纯化。由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA分子不同构象对迁移率的影响，常用于进行遗传病家系的单体型分析。

1、试剂：

1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g

N,N’-亚甲双丙烯酰胺1g

加去离子水至100ml 室温避光保存

2）10%过硫酰铵（APS）：过硫酰铵1g

加去离子水至10ml 4℃避光保存

3）TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）4℃避光保存

4）10×TBE：Tris碱108g

硼酸55g

0.5M EDTA(pH8.0) 40ml

加去离子水至1000ml 高压蒸气灭菌，室温保存5）8%丙烯酰胺（含50%尿素）：

丙烯酰胺38g

N,N’-亚甲双丙烯酰胺2g

10×TBE 25ml

尿素250g

加去离子水至500ml

室温避光保存

6）PBR322/MSPI DNA分子量标准：622bp /527bp/404bp/309bp/

242bp/238bp/217bp/201bp/190bp/180bp/160bp/147bp/123bp/110bp/97bp/

76bp/67bp/34bp

7）6×非变性载样缓冲液：二甲苯青FF 0.025g

溴酚蓝0.025g

0.5M EDTA(pH8.0) 300μl

蔗糖4g

加去离子水至10ml 4℃保存

2×变性载样缓冲液：二甲苯青FF 0.0083g

溴酚蓝0.0083g

0.5M EDTA(pH8.0) 100μl

加去离子甲酰胺至10ml 4℃保存8）固定液：无水乙醇50ml

冰醋酸 2.5ml

加一蒸水至500ml

染色液：AgNO31g

加一蒸水至500ml

显色液：NaOH 3.75g

甲醛（30%） 2.7ml

加一蒸水至500ml

2、操作步骤：

1）选择合适的垂直电泳槽与大小相配的两块玻璃板（其中一块为U形），及两玻璃板间的间隔片和点样梳。

2）用洗涤剂清洗干净两块玻璃板，烘干或晾干，然后用无水酒精擦洗一遍。

3）装配灌胶板：在两块玻璃板间放好间隔片，在玻璃板两边夹好夹子，插上点样梳，根据梳子的松紧调整间隔片及夹子的位置，在两块玻璃板的

底边封好一层胶带。

4）配制胶液（丙烯酰胺有神经毒，操作时要戴手套）。

6%非变性胶：30%丙烯酰胺6ml

10×TBE 1.5ml

10%过硫酸胺300μl

去离子水加至30ml

8%变性胶：8%丙烯酰胺（含50%尿素）50ml

10%过硫酸铵500μl

5）封底胶：胶液配好后，充分混匀，取出5ml胶液加入TEMED 10μl，快速混匀后迅速倒进两块玻璃板之间封底胶。

6）灌胶：待底胶凝固后，剩余胶液内加TEMED 20μl，混匀，将玻璃板倾斜，缓慢灌入胶液（注意灌胶时应连续，避免产生气泡，有气泡要及时

去除）。

7）胶液灌好后，在玻璃板上方插入相应的点样梳（插梳子注意去除梳齿下残留的气泡，且不要将梳子全部插入胶内，留约2mm在胶外，以免拔梳子时将胶孔桥拔断）。

8）室温下让凝胶聚合约1-2小时。

9）配制800ml 0.5×TBE电泳缓冲液（40ml 10×TBE加去离子水至800ml），混匀后，加入上下电泳槽中。

10）小心拔下梳子，用电泳槽内的TBE冲洗胶孔（避免残留的丙烯酰胺再聚合，导致点样孔不整齐，影响电泳的带形），去掉封口的胶带以及玻璃板两边的夹子，将胶板用固定夹固定在电泳槽上（有凹面的玻璃朝向电泳槽），接通电源，300V（400V）预电泳10分钟。

11）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在待上样的DNA样本中加入1/5体积的6×非变性载样缓冲液，混匀后上样（上样时注意不要有气泡冲散了样品，且上样速度尽量快些，以免样品扩散）。上样结束后，300V恒压电泳，待二甲苯青FF指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在待上样的DNA样本中加入等体积的2×变性载样缓冲液，置PCR自动热循环仪上95℃变性10分钟，变性结束后样本立即插入冰上，上样（上样前需用注射器将上样孔再冲洗一次，以免残留的尿素结晶使得DNA电泳带型模糊变形）。上样结束后350V 恒压电泳（最好是用带循环水装置的电泳设备于50℃恒温电泳，可保证胶板温度均匀），待二甲苯青FF指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。

12）电泳结束后取下胶板，小心掀开玻板，移去间隔片，用银染法显色：将凝胶小心移入一托盘内，固定液固定2分钟，一蒸水漂洗一次→染色液染色10分钟→一蒸水漂洗两次，每次半分钟→显色液显色，至出现清晰DNA产物带型，凝胶用一蒸水漂洗一次后，转移到保鲜膜上，用保鲜膜包好。电泳结果拍照或用图像处理系统进行扫描。

表2: 变性的聚丙烯酰胺凝胶中标准参照染料迁移率

表3：各浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制

3、常见问题及对策

问题可能原因解决办法

带模糊或拖尾1、胶板过热

2、缓冲液与凝胶TBE浓度

不一致

3、DNA量太多1、降低电压或缓冲液离子强度

2、用同一批TBE制胶及配制电泳缓冲液

3、减少点样量

带型扭曲1、上样孔变型

2、泳道上有气泡1、重新制胶

2、重新制胶

带型不平1、底胶不平

2、胶板两边松紧不一1、重新制胶

2、重新制胶

制胶时漏胶1、底胶没封好

2、胶带封口不严

3、所用试剂失效（主要是

10% APS）1、重灌底胶

2、重新封口

3、重新配制试剂