抑菌实验

一、菌种
(一)、细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）
和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；
(二)、真菌：啤酒酵母（Saccgaromyces cerevisiae）、米曲霉（Aspergillus
oryzae）3402、黑曲霉（Aspergillus niger）、叶点霉（Phyllosticta maydis ）和刺盘孢霉（Colletotrichum musae）
二、培养基
（一）细菌培养液：LB
液体：胰蛋白胨10.0g
酵母提取物 5.0g
NaCl 10.0g
10mol/LNaOH 100μL
蒸馏水定溶至1.0L
pH 7.0~7.4
如要配置固体LB培养基，加15.0g琼脂糖/L
(二)、真菌培养液：马铃薯培养基(PDA)
马铃薯(去皮切块) 200.0g
葡萄糖 20.0g
琼脂 18.0g，
蒸馏水 1000mL
pH 自然
三、器材
培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管
四、实验步骤
(一)、抑菌圈的测定(滤纸片法)
1、菌种接种
将保存菌种反复转种2次，使菌种新鲜，细菌置30℃，温箱培养1d，霉菌置27℃，温箱培养3d，备抗菌实验用。

2、菌悬液制备
在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水
(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃，置旋涡混合器混匀。

3、倒平板
在超净台里将培养基倒入平板，每板约15mL左右，水平放置，凝固后倒置放入30℃温箱中，2d后观察是否有菌落生长，若没有则可供下一步实验使用，否则需重新倒平板。

4、涂布在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用
三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板。

5、贴片在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用
无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。

每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。

6、培养24h后放入(倒置)培养箱中培养，细菌30℃，霉菌27℃。

细菌
培养24h后观察结果，霉菌72h后观察结果。

目测并以下列标准记录：“+”表示样品对受试菌有抑制作用，括号内为形成抑菌圈的直径，单位cm；“一”表示样品对受试菌无抑制作用。

(二)、最小抑菌浓度测定(MIC)—试管法
根据滤纸片法所得结果，参照文献对各受试菌种有作用的样品做试管法试验。

培养基以每管终体积5 m1分装于试管(18mm×180mm)中，在120℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min，当灭菌培养基冷却至50℃左右时，无菌操作加入样品充分混匀，倍比稀释成(体积比)系列浓度，无菌水作对照，分别制成斜面。

取生长良好的受试菌划线接种于斜面上。

细菌放于30℃温箱中，于24 h观察菌生长状态，真菌放于27℃温箱中，于72 h后观察结果，设置重复组。

目测并以下列标准记录：菌完全无生长“一”；菌生长迟缓，形成的菌落很小“+”：菌生长比较快形成菌落较大“++”；菌生长迅速但菌落比正常小“+++”；菌生长迅速与正常相同“+++十”。

取完全不生长管最低样品浓度为最低抑菌浓度(MIC)。