实验二、细菌染色法

1、简单染色法原理 这是最基本的染色方法，由于细菌在中性 环境中一般带负电荷，所以通常采用一种碱性 燃料进行染色（如美蓝、碱性复红、结晶紫、 孔雀绿、蕃红等）。这类染料解离后，染料离 子带正电荷，故使细菌着色。
2、革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要 鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为 革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大 类。
1、菌种:大肠杆菌18-24h琼脂斜面培养物 、葡 萄球菌18-24h琼脂斜面培养物、大肠杆菌与葡 萄球菌的混合菌液。 2、染液 （1） 简单染色液 （2） 革兰氏染液 3、其他物品： 显微镜、载玻片、香柏油、擦 镜纸、酒精灯、接种环、蒸馏水、染色架。
四、实验步骤
• （一）单染色法 取大肠杆菌或葡萄球菌中任一种进行单 染色。 • （二）革兰氏染色法 取另两种菌进行革兰氏复染。
革兰氏染色是利用细菌的细胞壁组成成分和结构 的不同。 革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的 肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使 孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复 合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。 革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，而 且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞 壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶 出细胞壁，因而细胞壁被脱色，再经蕃红复染后细胞
察(防止水的折射，以便于观察)。
Microbiological Sterile Techniques
染色时间：
吕氏碱性美蓝染色1~2min； 石炭酸复红染色约1min 草酸铵结晶紫染色约1min。
5、水洗
将细菌涂片上染液倒入废液缸中； 手持细菌染色涂片，臵于废液缸上方，用 洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无 色为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使 水从载玻片的一端流下。水流不宜过急， 过大，以免涂片薄膜脱落。
实验二 细菌染色法
一、目的要求
1、掌握细菌染色标本的制备。
2、掌握简单染色法、革兰氏染色法的原理及操
作步骤。
3、熟悉革兰染色法在鉴定细菌上的重要意义。
二、基本原理
细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使
菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，
从而有利于对细菌标本的观察。 细菌染色法可分为单染色法和复染色法两大类。
2、干燥
将涂好菌膜的载玻片平放在桌面上，
室温下自然干燥。
3、固定
手持已经自然干燥的涂好菌膜的载玻片， 涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，热 固定细菌细胞。
注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚 至破坏细胞形态。
4、染色
将热固定的细菌涂片平放于在桌面上，滴 加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜 为宜）。
球菌
肺炎链球菌
杆菌
炭疽杆菌
破伤风杆菌
肉毒芽孢杆菌
杆菌
变形杆菌
大肠杆菌
绿脓杆菌
螺菌
幽门螺杆菌
霍乱弧菌
钩端螺旋体
涂片
菌液涂片时不需滴加生理盐水； 注意练习无菌操作； 取菌不要贪多，接种环上肉眼可见菌苔 痕迹即可； 菌苔在生理盐水中涂片要均匀，局部不 宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。
• ⑴初染 将涂片臵于桌面上，滴加结晶紫 染色液于细菌涂抹处，使其布满菌膜，染 色1min。倾去染色液，用自来水小心地冲 洗去多余染液，甩净积水。 • ⑵媒染 滴加(Lugol)碘液覆盖菌膜，染 1min，水洗。 • ⑶脱色 滴加95%乙醇于载玻片上，直至流 下的乙醇无色，然后水洗（终止脱色）， 甩净。 • ⑷复染 滴加稀释复红染液于菌膜上，覆 盖住菌膜，染色1min，水洗，甩净，最后 用吸水纸轻轻吸干。
6、干燥
自然干燥：将染好色的细菌涂片平放在载 玻片架上，室温下自然干燥； 吹干：将染好色的细菌涂片平放在载玻片 架上，用电吹风冷风或低温热风吹干； 吸干：将染好色的细菌涂片平放在一张吸 水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂 片两面水分吸干。
7、镜检
• 涂片干燥后镜检（油镜）。
• 注意：涂片必须完全干燥后才能用油镜观
呈红色。
革蓝氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较
成分 占细胞壁干重的%
革蓝氏阳性菌 革蓝来自百度文库阴性菌
肽聚糖 含量很高（50-90） 含量很低（~10）
磷壁酸 含量较高（<50） 无 类脂质 一般无（ < 2） 蛋白质 无 含量较高（~20） 含量较高
革兰氏染色的意义
• 细菌分类鉴定 • 指导临床用药
三、实验器材
微生物分类鉴定的特征
形态学和生理生化特征 血清学实验和噬菌体分型 氨基酸序列和蛋白质分析 核酸碱基组成和序列分析
形态学特征
培养特征、菌落的形状、大小、颜色、表 面特征、光泽等 细胞形态：形状、大小、排列方式 特殊结构：鞭毛、芽孢、孢子、荚膜等 细胞内涵物 染色反应：革兰氏染色、抗酸性染色 运动性
• 干燥后，臵油镜观察。被染成紫色者即 为革兰氏阳性菌(G)；被染成红色者是 革兰氏阴性菌(G-)。
革兰氏阳性菌
革兰氏阴性菌
1、涂片
1. 取一块干净的载玻片平放在桌面上，在载玻片 中央滴一滴生理盐水（或蒸馏水）； 2. 无菌操作从试管中生长有琼脂斜面上挑取少许 菌苔； 3. 将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀 并涂成薄膜。 注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不 宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
（一）单染色法
涂片
干燥
固定
干燥
镜检
水洗
染色
（二）细菌的革兰氏染色法
染色方法
涂片制作
涂片固定
结晶紫初染1min
水洗
碘液媒染1min
水洗
乙醇脱色
水洗
G+ ：紫色 G- ：红色
番红复染1min
方法
涂片
初染
媒染
脱色 复染 镜检
五、思考题
• 1、比较单染色法和复染色法的优缺点？ • 2、革兰氏染色有哪些步骤，要注意哪些 步骤？为什么？ • 3、革兰氏染色有何实际意义？ • 4、细菌染色结果为红色就是G-吗？为什 么？ • 5、在你所做的革兰染色制片中细菌染成 了何颜色？并判断是G+还是G-?