链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用
生物素亲和素用于荧光免疫
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临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合， 室温搅拌下反应2 ～4小时；
4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃ 透析过夜；
5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻 存备用。
2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成 新的标记物。
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3、生物素标记抗体（IgG）的制备 基本原理 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-
C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽 键，从而使其标记上生物素。
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4、实验流程
1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶 液；
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素 -过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗（抗）体接触， 将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为 ABC法。
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17第三节生物素和亲和素系统的技术方法一桥联亲和素生物素法bridgedavidinbiotintechnologybab法lymphocytebab法直接法检测原理示意图18二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab间接法lab法直接法检测原理示意图20abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc23第四节技术评价与应用领域1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
的羧基经活化修饰 后形成的衍生物， 只有活化生物素才 能偶联各种其他生 物大分子，如蛋白 质、多糖、荧光素 等。
链酶亲和素
链霉亲和素商品化应用简介一、链霉亲和素性质链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。
链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。
链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015L／mol。
在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和Ｃ端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。
链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，１mg链霉亲和素的最高活性可达18U。
二、亲和素和链霉亲和素的比较相同点1、生物素结合能力：AV：13~15U，SA：14~18U2、活性中心依赖于色氨酸-懒氨酸：亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111两个位点有色氨酸-懒氨酸，链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两个位点含有色氨酸-懒氨酸。
不同点：1、分子量：AV=66KD, SA=54KD2、等电点：AV=10.5, SA=6.0, AV带正电较多，非特异性结合较强。
3、位阻效应：SA的生物素结合位点较AV深，位阻效应较强，长臂生物素更适合。
4、生物素的结合：AV随机结合，SA协同结合。
5、氨基酸序列：AV含二硫键和10%糖，SA含甘氨酸丙氨酸较多，无糖和二硫键。
三、链霉亲和素在ELISA中的应用酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第十三章免疫组织化学技术
第十三章免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。
减少对组织标本的损伤与挤压。
2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。
（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。
标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。
2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。
组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。
3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。
首选冷冻切片。
其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。
链霉亲和素-荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应用
华中科技大学硕士学位论文链霉亲和素-荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应用姓名：蔡芬芬申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：赵开弘2010-12摘要荧光免疫检测技术在现实生活中应用日益广泛，遍及环境污染物监测、医学检验、食品检验等诸多领域，发展迅速。
本研究所涉及的生物素-链霉亲和素系统（BSA）是具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的信号多级放大系统；同时藻胆蛋白的光学和物理性质非常符合新一代荧光免疫标记物的要求。
本研究以pUC57-sa质粒为模板，通过PCR反应扩增出目的基因片段sa，构建表达载体pETDuet-sa。
通过大肠杆菌异源表达，成功制备核心链霉亲和素，对其表达、活性和保存条件等方面进行研究，其分子量为59.2KD，理论活性为16.5u，实测活性16.3u，冻干后可以稳定保存。
将SA-CpcB、藻红胆素合成酶及藻胆蛋白裂合酶进行大肠杆菌体内共表达，得到融合色素蛋白SA-CpcB-PEB。
检测SA-CpcB-PEB的荧光活性，同时将其用于BSA 系统中进行荧光免疫检测，表明SA-CpcB-PEB同时具有藻胆蛋白的荧光特性和SA 与生物素结合的能力。
将SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于BSA荧光免疫检测体系检测微量物质，证实SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于荧光免疫检测体系具有实用意义。
通过研究温度、pH、抑制剂对SA-CpcB-PEB活性以及稳定性的影响，得到其适宜保存条件是4℃、终浓度为1mM EDTA、0.05﹪NaN3、pH为中性、20mM KPB、150mM NaCl的环境，有利于其具体应用。
关键词：荧光免疫荧光探针融合蛋白链霉亲和素藻胆蛋白AbstractFluorescence immunoassay is widely used by environmental pollutants monitoring, medicinal testing, food inspecting and other fields. In this research, Biotin-Streptavidin system(BSA) is a high sensitivity, good specificity and stability of multi-level signal amplification system. Phycobiliprotein could be applied to fluorescence immunoassay, as a new fluorescence probe.The Streptavidin gene was amplified by PCR from the plasmid of pUC57-sa and cloned by the transform of enzyme sites. Core Streptavidin was successfully constructed, and molecular weight is 59.2KD, theoretical activity is 16.5u, measured activity is 16.3u, can be preserved by lyophilized powder for long time.The fusion protein SA-CpcB-PEB was prepared by reconstitution SA-CpcB with PEB in vivo in E.coli. Tested the fluorescence and the property of binding with biotin of SA-CpcB-PEB, the results show that the fusion protein retained the two proteins’s bifunctional effects. By using SA-CpcB-PEB as a fluorescence probe to detect trace substances in BSA fluorescence immunoassay, we believed it can be used for fluorescence immunoassay.By studying the temperature, pH, different inhibitors on the activity and stability of℃the fusion protein SA-CpcB-PEB, got the better storage conditions is 4, 1mM EDTA, 0.05% NaN3, neutral pH, 20mM KPB, 150mM NaCl ,which is beneficial to the specific application.Key words：Fluorescence immunoassay Fluorescence probe Fusion protein Streptavidin Phycobiliprotein缩略词（Abbreviation）pair 碱基对bp baseDTT dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylenediamine tetracetic acid 乙二胺四乙酸coli 大肠杆菌E.coli EscherichiaIPTG isoprophyl thio-β-D-galactoside 异丙基硫代半乳糖苷Kan kanamycin 卡那霉素Amp ampicillin 氨苄青霉素Str streptomycin 链霉素Chl Chloramphenicol(chloromycetin) 氯霉素kD kilodalton 千道尔顿KPB potassium phosphate buffer 磷酸钾缓冲液ME β-mercaptoethanol β-巯基乙醇BSA Biotin Streptavidin System 生物素-链霉亲和素系统PEB phycoerythrobilin 藻红胆素PE Phycoerythrin 藻红蛋白SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳三（羟甲基）氨基甲烷Tris tris(hydroxymethyl)aminomethanerpm revolution per minute 每分钟转数独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
人胰岛素定量测定试剂盒化学发光免疫分析法的建立及方法学评价
人胰岛素定量测定试剂盒化学发光免疫分析法的建立及方法学评价陈超;彭波;李基【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2015(007)005【摘要】目的建立了一种定量测定人血清中胰岛素的化学发光免疫方法,并对其试剂盒性能进行方法学评价. 方法试剂盒采用双抗体夹心法,以磁微粒交联的单抗作为捕获抗体,碱性磷酸酶标记的单抗作为检测抗体,分别对本试剂盒的溯源性、参考范围、最低检测限、线性、准确度、精密性、分析特异性、抗干扰性、药物影响及样本比对方面进行评价. 结果用胰岛素NIBSC国际标准品(66/304)进行溯源,相关性方程为y=1.0335x +0.3349,相关系数r=0.999;建立了健康人群空腹血清胰岛素参考范围,覆盖2.5％～97.5％百分位数人群的参考值范围为1.59 μIU/mL～14.64 μIU/mL;对此方法建立的试剂进行了方法学评价,最低检测限可达0.08μIU/mL;线性在0μIU/mL～300 μIU/mL内,相关系数r=0.9999;精密性CV＜8％;准确度在±10％之内;当样本中的胰岛素浓度为200 000 μIU/mL时,未发现钩状效应;与Roche电化学发光系统测定结果显著相关,相关方程为y=0.9541x+0.177,相关系数r=0.9917,两种方法学的测定结果具有较高的一致性. 结论本研究建立的人胰岛素化学发光免疫分析定量检测试剂盒的各项性能指标均达到了临床检测要求,可用于临床血清胰岛素的检测.【总页数】5页(P313-317)【作者】陈超;彭波;李基【作者单位】上海科华生物工程股份有限公司,上海200233;上海科华生物工程股份有限公司,上海200233;上海科华生物工程股份有限公司,上海200233【正文语种】中文【相关文献】1.游离β人绒毛膜促性腺激素定量测定化学发光免疫分析法的建立与性能评价 [J], 伍华颖;王小艳;李志雄;董志宁;吴英松;徐伟文2.促黄体生成素定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的临床性能评价 [J], 周颖;方婉仙;吴英松3.硫酸去氢表雄酮定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的研制及性能评价 [J], 苏立;贾晨路4.总前列腺特异性抗原定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的性能验证 [J], 方婉仙;李志雄;董志宁;李明;吴英松5.癌胚抗原定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的临床性能评价 [J], 梁丽萍;李志雄;董志宁;李明;吴英松因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
生物素（biotin，B）, 又称维生素H 、B7,动 植物中广泛存在，卵黄 和肝中含量高；
MW244.31D,有两个环状 结构；
Ⅰ环为咪唑酮环，为与 亲和素结合部位；
Ⅱ环为噻吩环，含一个 戊酸侧链，其末端可与 生物大分子连接，形成 生物素标记物。
咪唑酮环 噻吩环
羧基
3
活化生物素 噻吩环上戊酸侧链
第十三章
生物素－链霉亲 和素标记免疫技术
Biotin-Avidin Labelling Immunoassay Tech
1
第一节 生物素和亲和素 第二节 生物素和亲和素标记物的制备 第三节 生物素和亲和素系统的技术方法 第四节 技术评价与应用领域
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T lymphocyte
第一节 生物素和亲和素
PAP-ABC复合法检测原理示意图
第四节 技术评价与应用领域
一、技术评价 1、生物素（B）和亲和素（A）之间的
高亲和力，使反应试剂经得起高度稀 释，降低或避免了非特异性结合； 2、二者均可偶联蛋白质、核酸、多糖 等活性物质； 3、具有多级放大作用，使其具有高灵 敏性；
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二、应用领域 1、BAS与免疫标记技术 适用于微量抗原、抗体及其他生物活性物质
可影响标记物活性，如碱性磷酸酶标记 后活性会降低；
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亲和素（avidin,A） 从蛋清中提取的一种碱性糖蛋白，耐热及多种
蛋白水解酶作用，每个分子由4条相同亚基组 成，每个亚基都可以结合一个生物素分子。 与生物素结合的特异性高、稳定性好。
K=1015L/mol（BA），K=105～11L/mol（antigen-antibody）
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二、亲和素标记物的制备 1、几乎所有用于标记的物质均可与亲
(完整)胰岛素(Insulin)作业指导书
(完整)胰岛素(Insulin)作业指导书胰岛素(Insulin)1.分析原理采用双抗体夹心法原理，整个过程18分钟完成。
·第1步:20µl标本、生物素化的抗胰岛素单克隆抗体和钌（Ru)标记的抗胰岛素单克隆抗体混匀，形成夹心复合物。
·第2步：加入链霉亲和素包被的微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。
·第3步:反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。
检测结果由机器自动从标准曲线上查出。
此曲线由仪器通过2点定标校正，由从试剂条形码扫入仪器的原版标准曲线而得。
2.标本要求血清：按标准常规方法采集。
血浆:肝素锂、EDTA-K3或柠檬酸钠抗凝.溶血有干扰，因为红细胞释放可降解胰岛素的肽酶。
标本在15－25度可稳定4小时,2－8度可稳定24小时，-20℃可稳定6个月。
只可冻融1次.含沉淀的标本使用前需离心.不要使用加热灭活的标本。
标本和质控品禁用叠氮钠防腐.标本、定标液和质控品在测定前应预温到室温；放入仪器后应在2小时内测定以避免蒸发的影响。
3.试剂、校准品、质控品和其他所需材料采用罗氏原装配套试剂。
试剂：M：链霉亲和素包被的微粒（透明瓶盖），1瓶，6。
5ml。
粒子浓度0。
72mg/ml，生物素结合能力： 470ng生物素/mg粒子。
含防腐剂。
R1：生物素化的抗胰岛素单克隆抗体（灰盖），1瓶，10ml，浓度高于1。
0mg/l，MES缓冲液0。
05mol/l，pH6。
0，含防腐剂。
R2：Ru(bpy)32+标记的抗胰岛素单克隆抗体(黑盖)，1瓶，10ml。
浓度1。
75mg/l，MES缓冲液0.05mol/l，pH 6.0含防腐剂.校准品(货号12017504)：Cal 1 低值定标液(白盖）,2瓶，1.0ml/瓶，胰岛素浓度约为5μU/ml，人血清,含防腐剂Cal 2 高值定标液(黑盖），2瓶，1.0ml/瓶，胰岛素浓度约为300μU/ml，人血清，含防腐剂质控品：Elecsys 通用质控品（PreciContorl Universal）1和2 ,货号11731416其他所需材料:Elecsys 2010、E170、E601或 E411分析仪Elecsys 2010和 E411分析仪需要：Elecsys 系统缓冲液（ProCell)货号11662988Elecsys测量池清洗液（CleanCell）货号11662970Elecsys 添加剂液（SysWash）货号11930346Elecsys 系统清洗液（SysClean）货号11298500Elecsys E170和 E601分析仪需要：Elecsys 系统缓冲液（ProCell）货号12135019Elecsys测量池清洗液(CleanCell）货号12135027Elecsys 系统清洗液（SysClean）货号112985004.仪器和校准使用仪器：瑞士罗氏诊断公司生产Elecsys 2010/E 170/E 601/E 411全自动电化学发光免疫自动分析仪仪器校准：每批Insulin试剂盒必须用新鲜试剂和Insulin Cal 1,Cal 2定标一次.另外，以下情况需要再次定标：Elecsys2010/E 170/E601/E 411：·一个月(同一批号试剂）· 7天（放置仪器上的同一试剂盒)各种分析仪均适用的情况：根据要求进行定标；如质控结果超出范围时；根据规定进行定标.5.操作步骤(以E 170为例）5。
链霉亲和素和生物素结合位点
链霉亲和素和生物素结合位点
链霉亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，具有四个与生物素（Biotin）亲和力极高的结合位点。
它是一种60-kDa的链霉菌avidinii细胞外蛋白，也是一种生物素结合蛋白，包含四个亚基，每个亚基都有一个生物素结合位点。
这种四聚体蛋白能与生物素形成非常稳定的复合物，因此，链霉亲和素在生物技术和医学研究中具有广泛的应用。
链霉亲和素与生物素的结合能力极强，这种结合具有高度的特异性和稳定性。
这种特性使得链霉亲和素在生物素标记技术中发挥了重要的作用。
例如，在免疫组织化学和免疫细胞化学中，链霉亲和素常被用作生物素化抗体的放大系统，通过链霉亲和素与生物素的结合，可以将生物素化的抗体与链霉亲和素连接在一起，从而增强信号的强度，提高检测的灵敏度。
此外，链霉亲和素还被广泛应用于蛋白质相互作用的研究。
通过将目标蛋白质与生物素标记，然后利用链霉亲和素与生物素的结合特性，可以方便地将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，从而实现对目标蛋白质的纯化和鉴定。
总的来说，链霉亲和素和生物素的结合位点为生物医学研究提供了强有力的工具。
这种结合具有高度的特异性和稳定性，使得链霉亲和素在生物素标记技术和蛋白质相互作用的研究中发挥了重要的作用。
随着科学技术的不断发展，链霉亲和素的应用领域还将不断扩大，为生物医学研究带来更多的可能性。
生物素-亲和素标记技术
生物素-亲和素标记技术孔令青;李勇;高洪;严玉霖【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2008(29)4【摘要】生物素-亲和素系统(BAS)是一种具有高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术,研究证明生物素与亲和素依靠接触表面均一的多层膜来维系其稳定的结合.随着不断的探索和研究,该技术现已发展出多种标记方法,例如桥-亲和素-生物素标记法、亲和素-生物素-过氧化物酶法、标记生物素-抗生物素法,由于该标记技术具有优秀的性质,因此很快渗透到多个学科,在细胞和抗原的定位和检测中体现出极其重要的作用.目前,BAS已广泛应用于免疫学、分子生物学和组织化学等领域,并取得较好的效果.文章对该技术的特点、方法和应用做了简述.【总页数】3页(P100-102)【作者】孔令青;李勇;高洪;严玉霖【作者单位】云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201;云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201;云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201;云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201【正文语种】中文【中图分类】R446.61【相关文献】1.链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用 [J], 吴在荣;王宏锐2.外源性生物素对基于生物素-链霉亲和素化学发光技术干扰的研究进展 [J], 刘栋;仝慧;陈斌;张宁;胡健;王晓琴3.抗亲和素鼠单克隆抗体增强亲和素-生物素免疫技术和免疫组织学染色的敏感性[J], W.F.Cassano;张红毅4.用亲生物素蛋白-生物素酶标法对植物凝集素亲和乳腺癌的初步观察 [J], 卢百川;黄泰安;贺晓英5.不同生物素检测系统在核酸分子杂交检测中的应用——Ⅲ 链霉亲和素-碱性磷酸酶标记生物素检测系统 [J], 刘钟瑸;杨秋霞;王丽群;赵玉莹;康洋;杨贵贞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种提高链霉亲和素-生物素反应体系化学发光试剂盒及其制备方法和应用与流程
一种提高链霉亲和素-生物素反应体系化学发光试剂盒及其制备方法和应用与流程本发明涉及一种提高链霉亲和素-生物素反应体系化学发光试剂盒及其制备方法、应用与流程。
传统的链霉亲和素-生物素反应体系在生物医学、生命科学等领域中得到广泛应用。
但是，由于链霉亲和素和生物素自身的结构特点，这种反应体系在某些实验条件下会出现不稳定、信号弱等问题，影响了实验结果的准确性和可靠性。
为此，本发明提出了一种新型的化学发光试剂盒，可以有效提高链霉亲和素-生物素反应体系的稳定性和灵敏度。
该化学发光试剂盒包括以下试剂：链霉亲和素偶联剂、生物素标记试剂、缓冲液、助催化剂、基质和底物等。
其中，链霉亲和素偶联剂和生物素标记试剂经过特殊改进处理，使其具有更高的稳定性和灵敏度，同时缓冲液和助催化剂等试剂的配方也得到优化和升级，保证了整个反应体系的稳定性和灵敏度。
该发明的制备方法包括以下步骤：将链霉亲和素偶联剂和生物素标记试剂按照一定的比例混合，经过反应后得到链霉亲和素-生物素复合物；将复合物与缓冲液、助催化剂、基质和底物等试剂按照一定的比例混合，形成最终的化学发光试剂盒。
该化学发光试剂盒在实验中具有灵敏度高、信号稳定、操作简便等优点，可以广泛应用于分子生物学、免疫学、医学诊断等领域，为科研工作者提供了一种有效的实验工具。
其流程如下：1. 样品处理：将待测样品进行处理和稀释，使其适合于试剂盒反应体系。
2. 添加试剂：向样品中加入化学发光试剂盒中的试剂，混匀均匀。
3. 反应：样品中的目标物与试剂盒中的链霉亲和素-生物素复合物发生特异性结合反应，产生化学发光信号。
4. 测量：利用化学发光仪或者其他检测设备对发光信号进行检测和记录，得到最终的实验结果。
以上是一种提高链霉亲和素-生物素反应体系化学发光试剂盒及其制备方法、应用与流程。
生物素-亲和素或链霉亲和素的无微球均相化学发光体系[发明专利]
![生物素-亲和素或链霉亲和素的无微球均相化学发光体系[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/ce27a8e081eb6294dd88d0d233d4b14e85243e38.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911152753.3(22)申请日 2019.11.22(71)申请人 无锡壹闪生物科技有限公司地址 214174 江苏省无锡市惠山经济开发区惠山大道1699号50305室(72)发明人 奚伟红 (74)专利代理机构 北京酷爱智慧知识产权代理有限公司 11514代理人 魏星(51)Int.Cl.G01N 21/76(2006.01)G01N 33/536(2006.01)G01N 33/532(2006.01)(54)发明名称生物素-亲和素或链霉亲和素的无微球均相化学发光体系(57)摘要本发明公开了生物素-亲和素或链霉亲和素的无微球均相化学发光体系，以及将其用于定量测量抗原或抗体的方法，涉及化学发光体系技术领域，所述的无微球均相化学发光体系包括：生物素标记的抗体或抗原、9,10-二氢吖啶标定的抗体或抗原、HRP标记的亲和素或链霉亲和素。
生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素的无微球均相化学发光(No Microspheres HonogeneousLuminescent(Biotin -Avidin/streptavidin))体系不使用微球，是均相体系；引入生物素-亲和素/链霉亲和素系统，可以大大提高化学发光效率，提高检测灵敏度，实例S100B蛋白最低检测浓度可达到0.015ng/ml；该体系检测过程不需清洗，方便简单，可用于自动免疫均相化学发光系统，POCT及微流控芯片等快速定量分析。
权利要求书1页 说明书8页 附图1页CN 110779912 A 2020.02.11C N 110779912A1.一种基于生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素的无微球均相化学发光体系，其特征在于：包括：生物素标记的抗体或抗原、9,10-二氢吖啶标定的抗体或抗原、HRP标记的亲和素或链霉亲和素。
2.根据权利要求1所述的无微球均相化学发光体系，其特征在于：所述的制备HRP标记的亲和素或链霉亲和素的步骤如下：在1mg HRP中加入60mmol/L NaIO40.1ml于4℃作用30分钟，再加入0.1ml浓度0.16mol/L的乙二醇，30分钟后，加入1mg A或SA ,4℃静置24小时；透析过夜，加等体积的饱和硫酸铵溶液，4000r/min离心15分钟，将沉淀物溶解于PBS中，280nm 下测吸光度并进行200-280nm波长扫描；用Sephadex G -75装柱，HRP -SA或HRP -A上样100ul，用0.025mol/L KCL -0.2mol/L乙酸缓冲液，以0.5ml/2min的速度淋洗，分部收集；用DU800紫外分光光度计测量收集各管样品的OD280值，绘制洗脱曲线，收集单白峰，透析液用PEG -2000进行浓缩；取1的HRP -SA或HRP -A和100ul去离子双蒸馏水，用紫外分光光度计在200-280nm波长扫描，至HRP -SA在280nm处有吸收峰。
链霉亲和素-生物素放大免疫酶法在鼻咽癌诊断中的临床应用
链霉亲和素-生物素放大免疫酶法在鼻咽癌诊断中的临床应用周珣;吴皖【摘要】目的分析链霉亲和素-生物素放大免疫酶法在鼻咽癌检测当中的临床价值.方法选取2009年3月至2013年1月在孝感市中心医院就诊具有高度鼻咽癌危险的患者326例,分别进行链霉亲和素-生物素放大免疫酶法和常规免疫酶法检验,对链霉亲和素-生物素放大免疫酶法与常规免疫酶法在鼻咽癌患者117例与鼻咽癌高危人群但是无鼻咽癌患者209例的IgA/VCA和IgA/EA的检出率进行观察.结果在鼻咽癌患者中,链霉亲和素-生物素放大免疫酶法的IgA/VCA检出阳性率为99.16%,高于常规免疫酶法的92.31%,IgA/EA检出阳性率为78.63%,高于常规免疫酶法的56.41%(P<0.05).鼻咽癌高危人群但是无鼻咽癌患者,链霉亲和素-生物素放大免疫酶法的IgA/VCA检出阳性率为24.88%,与常规免疫酶法检出阳性率(23.92%)差别无统计学意义(P>0.05),IgA/EA检出阳性率为3.83%,而常规免疫酶法为0.结论链霉亲和素-生物素放大免疫酶法能够较常规免疫酶法更为灵敏地诊断鼻咽癌.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2014(020)003【总页数】2页(P566-567)【关键词】鼻咽癌;EB病毒;链霉亲和素-生物素放大免疫酶法【作者】周珣;吴皖【作者单位】孝感市中心医院检验科,湖北,孝感,432000;孝感市中心医院检验科,湖北,孝感,432000【正文语种】中文【中图分类】R331鼻咽癌是临床常见的头颈部恶性肿瘤性疾病，鼻咽癌在全球大多数地区和国家并不呈现高发态势，主要的发病地区集中于亚洲，其中中国是鼻咽癌的高发国家，鼻咽癌在我国广东地区的发病率已经达到20/10万[1]，而在上海地区发病率为4.7/10万[2]，由于我国人口基数较大的原因，每年新增的鼻咽癌患者人数在10万人次之上，发病情况在恶性肿瘤性疾病中不容乐观，晚期鼻咽癌可侵犯患者的脑神经、三叉神经并且可以影响患者正常的视力和听力，远处转移可造成患者死亡。
碱性磷酸酶标记的链霉亲和素-生物素法(SAP法)
免疫组织化学实验二
实验材料
1、小鼠胰腺的石蜡切片； 2、胰岛素抗体（鼠抗人单克隆抗体）； 3、SAP检测试剂盒； 4、正常羊血清； 5、 0.01M PBS（pH7.2～7.6） ； 6、BCIP/NBT显色试剂； 7、孵育湿盒。
实验原理
物抑制 3. 正常血清封闭
4. 第一抗体 5. 多聚骨架复合物 6. 显色
实验步骤
1、石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3×3min； 2、3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化
物酶的活性；蒸馏水洗，PBS浸泡5min； 3、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液， 37℃
孵育1hr； 4、 PBS冲洗，3×3min； 5、 滴加HRP标记羊抗小鼠Ig多聚体，37℃或室温孵
育20～30min； 6、 PBS冲洗，3×3min； 7、显色剂显色（AEC或DAB）； 8、自来水充分冲洗，封片。
结果：
胰岛内可见棕色着色的阳性细胞，阳性产物见 于细胞质。
组织抗原 一抗 HRP 多聚化合物骨架
EPOS 方法
原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP---多聚化合物---特异 性抗体。
步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强，
敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵
二、EnVision法（或PowerVison） Enhanced Labelled Polymer System
20min。 PBS冲洗，3×3min； 7、显色剂显色（BCIP/NBT）； 8、自来水充分冲洗，封片。
结果
胰岛内可见蓝色或紫蓝色着色的阳 性细胞，阳性产物见于细胞质
应用生物素_链霉亲和素的时间分辨荧光免疫分析检测玉米赤霉烯酮_马智鸿
江苏农业学报(J i a n g s uJ .o f A g r .S c i .),2009,25(4):905～909应用生物素-链霉亲和素的时间分辨荧光免疫分析检测玉米赤霉烯酮马智鸿1, 黄 飚1, 屠 蔷2, 高 蕾2, 张 珏1, 王 柯1(1.江苏省原子医学研究所,卫生部核医学重点实验室,江苏无锡214063;2.江南大学生物工程学院生物制药系,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214036)收稿日期:2009-02-05基金项目:国家“863”项目(2008A A 10Z 415);科技部中小企业创新基金项目(06C 26213201075)作者简介:马智鸿(1982-),男,陕西榆林人,学士,研究实习员,主要从事标记免疫及真菌毒素的检测。
通讯作者:黄 飚,(E -m a i l )j s w x h b @163.c o m 摘要: 采用基于生物素(B i o t i n )-链霉亲和素(S t r e p a v i d i n )的时间分辨荧光免疫分析(T R F I A )技术建立了快速灵敏的玉米赤霉烯酮(Z E N )检测方法。
以s t r e p a v i d i n 包被板条,加入生物素化的Z E N -B S A ,结合在板条上的Z E N -B S A 与标准/样本中的游离Z E N 共同竞争限量的抗Z E N 单克隆抗体,用稀土离子E u 3+标记的羊抗鼠I g G 进行示踪,建立了间接竞争的Z E N -T R F I A 。
该方法的检测灵敏度为0.2n g /m l ,测量范围是0.2～200.0n g /m l ,批内、批间变异系数分别为5.7%和8.3%,平均回收率为91.1%。
与玉米赤霉醇的平均交叉反应是12.3%,与赭曲霉素A 、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉素B 1无交叉反应,说明该方法的特异性较好。
相关试剂在4℃放6个月后各检测参数基本无变化,说明该方法稳定。
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参考 文献
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癌组织 中呈现出表达 的下调或缺失 ， 且与 胃腺癌的病理分期 有关 ， 病理进程后期 与组织 类型也 有一定 的关 系 ， 提示其表 达 的下调或缺失可能是 胃癌发生 、 发展过程 中的～个重要环 节。为 Ｒ Ｎ ３基因成 为 胃癌诊 断的生物学标记和 胃癌治疗 ＵＸ 的基 因靶标提供 新 的实验证 据。进一步研 究导致其 下调或 缺失具体机制 ， 将有 助于揭 示 胃癌发生 、 展的 内在 分子学 发 变化 ， 而揭示 胃癌发生 、 进 进展 的本质 。
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