水的细菌学检查

24h和48h产酸产气的初发酵菌落均需在 伊红美蓝琼脂或复红亚硫酸钠培养基上， 进行平板划线，分离出阳性菌落。
3．复发酵试验 阳性菌落经涂片染色鉴别为G-，无芽 孢杆菌者，再经过乳糖蛋白胨液体培养 基进行复发酵试验，经24h培养产酸产气 者，可确认为大肠菌群阳性结果。
三．实验用品
培养基： （一）牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 （二） 乳糖蛋白胨液体培养基 3倍浓缩乳糖蛋白胨液体培养基 红美蓝琼脂培养基（制成平板）
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30， 则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释 倍数进行报告。 （6）若所有稀释度的平均菌落数均不在 30～300之间，则以最接近300或30的平 均菌落数乘以稀释倍数进行报告。
四、实验操作
（二）多管发酵法测定水中的大肠菌群 1. 水样采集 2. 自来水检查 （1）初（步）发酵试验 （2）平板分离 （3）复发酵试验
2.细菌总数的测定 (1)自来水 (2)池塘水、河水或湖水 ①水样稀释 ②吸取稀释后水样加入平板 ③向平皿内倾注培养基(15～20mL) ④37℃温箱，倒置培养24h，进行菌落计数
水样稀释 取1ml水样加入到9ml无菌水的试管，振 1 荡混匀，得稀释度为10－1； 从10－1管中取水样1ml加到第二支9ml无 菌水的管中，振荡混匀，得10－2……
大肠菌群的测定 若水源被粪便污染，则有可能也被肠 道病原菌污染，然而肠道病原菌在水中容 易死亡与变异，因此数量较少，要从中特 别是自来水中分离出病原菌常较困难与费 时，这样就要找到一个合适的指示菌，此 指示菌要求是大量出现在粪便中的非病原 菌，并且和水源病原菌相比是较易检出的。
若指示菌在水中不存在或数量很少，则 大多数情况也保证没有病原菌。最广泛 应用的指示菌是大肠菌群(coliform group)。 大肠菌群的定义是：一群好氧和兼性厌氧、 革兰氏阴性、无芽胞的杆状细菌，并在乳糖 培养基中，经37℃，24～48 h培养能产酸产气。 根据水中大肠菌群的数目来判断水源是否被 粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌 污染的可能性。
100 － － － － － － － ＋
接种水样量\ml 10 1 － － － － － ＋ ＋ －＋ － －
<9 9 9 9.5 18 19 22 23
六、思考题
你所测的池塘水、河水或湖水的污秽程度如何? 通过实验你对保护水源水有何看法？ 大肠菌群的定义是什么？ 假如水中有大量的致病菌——霍乱弧菌，用多 管发酵技术检查大肠菌群，能否得到阴性结果？ 为什么？ EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠 菌群时，各起什么作用？ 经检查，水样是否合乎饮用标准？
2．平板分离 平板分离用培养基通常为： 伊红美蓝琼脂（eosin metylene blue agar EMB agar）； 复红亚硫酸钠琼脂（亦称远藤氏培养基 Endo’s medium）。
（1）伊红美蓝琼脂培养基中含有伊红与美 蓝这两种苯胺类染料，它们不但可以抑制 +菌和一些难培养的G-菌，而且在低酸度 G 时，两种染料结合形成沉淀，起着产酸指 示剂的作用。大肠菌群因其强烈发酵乳糖 而产生大量的混合酸，使菌体表面带上正 电荷，可染上伊红染料，伊红与美蓝结合， 菌体被着上深紫色，在含有两种染料呈紫 色的培养基上，形成带核心、具金属光泽 的菌落。
五、实验结果
池水、河水或湖水阳性结果记“＋”； 阴性结果记“－”。 查表2-14得每升水样中大肠菌群数是多 少？
表2－14 大肠菌群检索表 －
接种水样量111.1ml（100+10+1+0.1）
三倍浓缩乳糖蛋 白胨50、 白胨 、5ml 普通浓缩乳糖蛋 白胨10、 白胨 、10ml
每升水样中大 肠菌群数
如有下列情况的出现，其结果判断需谨 慎。 （1）个别其他类型的细菌在上述条件下也 可能产气，需进行下述试验（即平板分 离和复发酵试验）才能进一步确证。 （2）培养24h后产酸，但未见产气者，不 能立即判断为阴性结果，由于菌量少， 也可能延迟至48h后才产气，应视为可疑 结果，也需进行下述试验（即平板分离 和复发酵试验）进一步确证，48h后仍不 产气，可判断为阴性结果。
一、实验目的
1．学习水样细菌总数的测定方法。 2．掌握水中大肠菌群的测定方法。 3．了解大肠菌群的数量与生活饮用水的 重要性。
二、实验原理
（一）细菌总数的测定 水中的细菌总数可反映出水体被有机 物污染的程度。细菌总数越多，说明水 中有机物的含量就越高。
本实验应用平板菌落计数技术来测定水 样中的细菌总数。 肠道中的绝大多数腐生性和致病性的细 菌，可在营养丰富的牛肉膏蛋白胨培养 基上进行生长，出现肉眼可见的菌落。
粪大肠菌群 粪大肠菌群（fecal coliform）是能在 44.5℃（44～45 ℃）发酵乳糖的大肠菌 群（thermotolerant coliform），以埃希氏 菌属为主。 在人粪中粪大肠菌群细菌占总大肠菌群 数的96.4%；在外环境中粪大肠菌群不易 繁殖，因此，粪大肠菌群较总大肠菌群 作为粪便污染指示菌意义更大。
我国规定每升自来水中大肠菌群数不超过3 个； 若只经过加氯消毒即供作生活饮用水的水 源水，大肠菌群数平均每升不得超过1000 个； 经过净化处理及加氯消毒后供作生活饮用 水的水源水，其大肠菌群数平均每升不得 超过10000 个
检查大肠菌群的方法有多管发酵法与滤 膜法两种。 多管发酵法使用历史较久，又称水的标 准分析方法，为我国大多数卫生单位与 水厂所采用； 滤膜法是一种快速的替代方法，而且结 果重复性好，又能测定大体积的水样， 目前国内已有很多大城市的水厂采用此 法。
①深紫黑色、有金属光泽。 ②紫黑色、不带或略带金属光泽。 ③淡紫红色、中心颜色较深。 在伊红美蓝这种鉴别性培养基上，大肠 菌群呈现特征性菌落，因此，凡是出现 这种菌落可确认为是大肠菌群。
（2）复红亚硫酸钠培养基中含有碱性复红 染料，大肠菌群发酵乳糖产生的有机酸和 乙醛与复红反应形成深红色复合物，菌落 呈现带金属光泽的深红色。培养基中的亚 硫酸钠可使复红脱色，培养基为淡粉红色， 同时还可抑制其他杂菌生长。在这种鉴别 性培养基上，大肠菌群也呈现特征性菌落。
1．初发酵试验 初发酵试验的液体培养基含有乳糖、蛋 白胨和溴甲酚紫。 乳糖起选择性碳源的作用，大肠菌群 可发酵乳糖产酸（有机酸），产气 （CO2+H2）。 溴甲酚紫是pH指示剂（碱性条件：紫 蓝色；酸性条件：黄色，变色点 pH=6.7）。
将水样接种在具倒置杜汉氏小管的发酵 管内，于37℃下培养，24h后杜汉氏小管 的顶端出现气泡，表明有气体产生，培 养基混浊，颜色变黄，说明水中存在大 肠菌群，视为阳性结果。
水的细菌学检查
生活用水的水源常被生活污水或工业废 水或人与动物的粪便所污染。 粪便污物含有不同类型的微生物，有腐 生性的和病原性的。 腐生性微生物对人无害，而病原性微生 物则能引起传染病的发生。
水源水如湖水、河水、池水和溪水，常 含有很多腐生菌，但仍可安全地饮用。 水源一旦被粪便污染，就可能也被肠道 病原体污染而引起肠道传染病甚至流行 病，如霍乱、伤寒、细菌性痢疾和阿米 巴性痢疾以及脊髓灰质炎和传染性肝炎 等病毒性疾病。 因此必须对生活用水及其水源水进行严 格的细菌学检查。
ll 18 27 38 52 70 92 120 16l 230 >230
四、实验操作
（二）多管发酵法测定水中的大肠杆菌 1. 水样采集 2.池塘水、河水或湖水等的检查 （1）将水样稀释成10-1 与10-2 。 （2）吸取稀释后水样 。
分别吸取1mLl0-2、10-1的稀释水样和1mL 原水样，各注入装有10mL普通浓度乳糖 蛋白胨发酵管中。另取10mL和100mL原 水样，分别注入装有5mL和50mL三倍浓 缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。 （3）平板分离和复发酵试验。
3.菌落计数方法 （1）计算相同稀释度的平均菌落数 。 （2）选择平均菌落数在30～300之间稀释 度的平板。当只有一个稀释度的平均菌 落数符合此范围时，则以该平均菌落数 乘以稀释倍数，作为该水样的细菌总数 进行报告。
（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在 30～300之间，则按两个稀释度菌落总数的 比值来决定取数。如比值小于2，应取两者 的平均数；如比值大于2，则取其中较小的 菌落总数进行报告。 （4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300， 则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释 倍数进行。
测定水样是否合乎饮用标准，通常包括 下列两个项目：
细菌总数测定 大肠菌群的测定
细菌总数测定 水中细菌总数可说明被有机物污染的 程度。细菌数越多，有机物质含量越大。 细菌总数是指1ml水样在普通琼脂培养 基中，37℃经24 h 37 24 h培养后，所生长的菌落 数。 我国规定自来水1ml的总菌数不得超过 100个。
表2-13 大肠菌群检数表 （水样100ml*2＋10ml*10）
100mL水量的阳性管数 10mL水量的阳性管数
O
每升水样中 大肠菌群数
l
每升水样中 大肠菌群数
2
每升水样中 大肠菌群数
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
<3 3 7 11 14 l8 22 27 3l 36 40
4 8 13 18 24 30 36 43 51 60 69
水中细菌总数的测定和计算是指：在牛 肉膏蛋白胨琼脂培养基上，lmL水样，经 37℃，24h培养后所生长出来的菌落数 （包括腐生和致病细菌）。 我国饮用水的卫生学指标规定：在lmL自 来水中细菌总数不得超过100个。
二、实验原理
（二）水中大肠菌群的测定（多管发酵法） 多管发酵法包括：初发酵试验、平板分 离和复发酵试验三部分。
四、实验操作
（一）细菌总数的测定 1. 水样采集 自来水 将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再拧开水龙 头流水5min，以排除管道内积存的死水，随后用已 灭菌的三角瓶接取水样，以供检测。 池水、河水或湖水 将无菌的带玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深 的水层中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装 满后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存 于冰箱，但不能超过24h。