真菌 染色

、概

述

真菌是指具有真正细胞核、产生孢子、不含叶绿素，以寄生或腐生方式吸取养料，能进行有性和(或)无性繁殖，具有纤维素(或其他葡聚糖)或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、TB、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量X线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件．近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。

真菌分为浅部真菌和深部真菌。浅部真菌：主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。临床最多见的浅部真菌病有：体癣、股癣、手癣和足癣。深部真菌：指侵犯表皮以外组织和器官的病原菌和条件致病真菌.；按生物学性状的不同又分为：酵母型、酵母样型、丝状菌型、双相型。深部真菌常见的有：念珠菌，隐球菌，组织胞浆菌,马尔尼菲青霉菌，曲霉，毛霉菌,孢子菌丝等。

二、常见真菌的形态特征

真菌的大小差异悬殊，大者如碗口，不属微生物范畴，例如灵芝；小者肉眼看不到，只能用显微镜观察。真菌的形态分单细胞和多细胞两种类型，单

细胞真菌呈圆形或卵圆性，常见于酵母菌和酵母样菌；多细胞真菌多呈丝状，分枝交织成团，也称为丝状菌，即一般通称为霉菌。

三、真菌的基本结构

真菌由菌丝和孢子构成。孢子是真菌的生殖结构，分为有性孢子和无性孢子。在适宜条件下，菌丝是由孢子生出芽管，逐渐延长呈丝状，生物学上把真菌的每一根细丝叫做菌丝。

四.真菌的染色方法

真菌用H-E染色一般着色不良，因此需用特殊的染色方法来显色，六胺银法（GMS）用铬酸氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基还原六胺银内的银离子为黑色的金属银而显色。PAS法用高碘酸氧化真菌菌壁的多糖游离出醛基，后者与无色品红结合生成新的品红色复合物而被显色。这两种方法可显示大多数真菌，是最广泛最常用的染色方法。

近年来，有报道用网状纤维的染色方法（G-S）来显示真菌，特别是曲球菌的染色显示效果较佳。现对常见的几种真菌作以下三种染色方法进行探讨。

（一）六胺银染色方法(GMS)

1.操作方法：

⑴切片脱蜡至水。

⑵8%铬酸水溶液氧化20分钟，自来水稍洗。

⑶0.5%偏重亚硫酸钠液处理1分钟，流水冲洗5分钟，再用蒸馏水洗2次。

⑷浸入已预热（约15-30分钟）的六胺银工作液中分三种方式处理：

①水浴锅内恒温处理（50-52℃）：先将已盛有六胺银工作液的5片装高

身染色缸置入水浴锅内预热15-30分钟，再将处理好的玻片置入六胺银工作液中反应30-60分钟，中途显微镜观察，至见到菌丝呈黑褐色为止。

②电热恒温箱内处理（58℃-60℃）：方法同上，在六胺银工作液中反应

的时间较长需60-90分钟, 蒸馏水稍洗.

③微波炉滴染：取微波炉专用蒸盒，底放50ml水，用于吸热保湿；玻片

放置隔层，滴加六胺银工作液于组织上，火力3档5-6分钟,蒸馏水稍洗.

⑸滴加0.1%氯化金溶液调色2-3分钟,蒸馏水洗。

⑹3%硫代硫酸钠液处理2-5分钟, 流水冲洗5分钟。

⑺用橙黄G复染1-2秒（首选）或用Mayer氏苏木素浅染，伊红复染。

⑻常规脱水透明封片。

2．染色结果：

各种真菌均被着色，菌丝和孢子呈明显的黑褐色。背景为：橙黄色（橙黄G复染），红色（伊红复染）。

※3．注意事项：

六胺银染色是显示真菌效果最佳的一种方法，为了获得菌体及背景清晰的染色效果，首先必须做好准备工作，染色过程需用的玻璃器皿要洁净，尽量避免使用过久的蒸馏水配制试剂，建议使用双蒸水，这样才能保证六胺银工作液的纯度，避免杂质沉淀影响观察。其次病理技术人员应掌握常见真菌的一般形态特征，并根据实验室的具体情况选择合适的孵育条件，摸索孵育时间和温度。在显微镜下观察染色程度时，低倍镜下颜色不要太黑，至深棕褐色即可，经0.1%氯化金溶液调色后，真菌从深棕褐色变成棕黑色，真菌壁和孢子着色。

4．过染的补救措施：

可用1%铁氰化钾与2%硫代硫酸钠1:1混合备用，临用时将此混合液再稀释2-3倍，滴入玻片上使组织减色，镜下观察。

（二）高碘酸—无色品红(PAS) 法

1．操作方法：

(1) 切片脱蜡至水。

(2) 0.5%高碘酸氧化5-8分钟。

(3) 流水冲洗2分钟，再用蒸馏水洗。

(4) 入无色品红液于暗处并加盖作用10-20分钟。

(5) 0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次，每次约1分钟。

(6) 流水冲洗5分钟。

(7) 0.2%亮绿水溶液复染。

(8) 稍水洗。

(9) 常规脱水透明封片．

2．染色结果：

真菌菌丝和孢子呈品红色，其他组织绿色

3．注意事项：

无色品红液(Schiff氏试剂)的试剂配制主要是试剂的纯度要高，才能配制出理想的无色品红液，染色才能成功。

（三）银氨液浸染法（G-S法）

1.操作方法：

(1) 切片脱蜡至水

(2) 切片滴入0.5%酸化高锰酸钾液，氧化5分钟，稍水洗。

(3) 2%草酸水溶液漂白1-2分钟，稍水洗。

(4) 2%硫酸铁铵水溶液媒染5分钟，再用蒸馏水洗一次。

(5) 滴入G-S氏银氨液作用10-30秒，蒸馏水稍洗。

(6) 10%中性甲醛液还原30秒，流水冲洗数分钟。

(7) 滴加0.1%氯化金溶液调色2-3分钟（镜下观察），水稍洗。

(8) 3%硫代硫酸钠液处理2-5分钟（镜下观察），流水冲洗5-10分钟。

(9) 核固红液复染5-10分钟，稍水洗，常规脱水透明封片。

2.染色结果：

网状纤维及真菌呈棕黑色，胞核红色（核固红复染），胶原纤维黄棕色，胞质淡红色（伊红复染）。

3.注意事项：

⑴配制银氨液的蒸溜水要纯，滴入银氨液作用不要超过1分钟，最好控制在10-30秒已足。

⑵ 10%中性甲醛还原不要超过1分钟，最好控制在30秒，否则容易出现银氨沉淀，影响观察。

五、几种真菌的显示特点

1．新形隐球菌在镜下多呈圆形，直径为4-20微米，菌体周围有一层宽阔的具有折光性的胶质样荚膜包绕，荚膜厚3-5微米，为一种粘多糖物质所组成，爱先蓝染色和粘液胭脂红染色呈阳性反应。六胺银染色也能很好地显