真菌 染色
真菌显色操作方法有哪些
真菌显色操作方法有哪些
1. 石蜡切片染色法：将真菌标本制成石蜡切片后，利用不同染色剂如甲苯胺蓝、格里姆萨染色等，可以观察到真菌结构和形态。
2. 孢子染色法：利用孢子染色剂如印度墨、墨汁等，可以染色真菌产生的孢子，从而观察孢子的形态和颜色。
3. 真菌培养液显色法：将真菌培养在特定培养基上，加入染色剂（如丙酮、甘油、苏木精等）后，可以观察到真菌的颜色和形态。
4. 酶标法（ELISA）：利用酶标法可以通过特定抗体和酶标记物来检测真菌的存在和数量，从而进行显色操作。
5. 荧光染色法：利用荧光染色剂如DAPI等，可以染色真菌的细胞核或细胞质，从而在荧光显微镜下观察真菌的结构和形态。
真菌染色
最近在看关于真菌的染色方面的资料，现在总结一下发出来，大家共同学习一下。
一、背景介绍真菌属于真核生物，没有质体，营养方式为吸收，无吞噬作用。
细胞壁含有甲壳质和β-葡聚糖。
可引起人类，动物的疾病，称为真菌病，还可引起植物的疾病、人类过敏性疾病和真菌毒素中毒症。
真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量X线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件．近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。
因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。
真菌分为浅部真菌和深部真菌。
浅部真菌：主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。
临床最多见的浅部真菌病有：体癣、股癣、手癣和足癣。
深部真菌：指侵犯表皮以外组织和器官的病原菌和条件致病真菌.；按生物学性状的不同又分为：酵母型、酵母样型、丝状菌型、双相型。
深部真菌常见的有：念珠菌，隐球菌，组织胞浆菌,马尔尼菲青霉菌，曲霉，毛霉菌,孢子菌丝等。
真菌的形态分单细胞和多细胞两种类型，单细胞真菌呈圆形或卵圆性，常见于酵母菌和酵母样菌；多细胞真菌多呈丝状，分枝交织成团，也称为丝状菌，即一般通称为霉菌。
由菌丝和孢子构成。
孢子是真菌的生殖结构，分为有性孢子和无性孢子。
在适宜条件下，菌丝是由孢子生出芽管，逐渐延长呈丝状，生物学上把真菌的每一根细丝叫做菌丝。
二、常用检查方法1、直接镜检：直接镜检的方法方便经济，可采用不染色的湿片如KOH涂片或乳酸酚棉蓝涂片。
对浅表和皮下真菌感染最有帮助，一般在有菌部位发现大量真菌菌丝即可作出诊断，可在几分钟内完成，并且观察到的真菌形态可以提供有价值的临床信息。
但是缺点在于阳性率较低，隐形结果也不能排除诊断。
2、真菌的染色方法：①革兰染色：所有真菌真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。
荧光染色法在浅部真菌检验中的应用
荧光染色法在浅部真菌检验中的应用
浅部真菌感染是指真菌进入宿主体内以感染皮肤、毛发、指甲或黏膜等浅部组织的疾病，临床上常见的浅部真菌感染包括白癜风、皮肤癣、顽固性皮肤炎等。
荧光染色法是一种用于检测真菌感染的常见方法之一，在浅部真菌检验中也有着广泛的应用。
本文将详细介绍荧光染色法在浅部真菌检验中的应用。
一、荧光染色法的基本原理
荧光染色法是一种基于荧光原理的染色方法，其中荧光染料被用于特定的细胞结构的可视化。
在真菌检测中，荧光染色法被广泛用于检测真菌细胞结构和组分。
进一步说，荧光染色法能够区分不同类型的真菌，并可以帮助确定真菌感染的性质和严重程度。
二、荧光染色法的现场应用
荧光染色法在现场应用时非常方便，需要用到的材料有：荧光染料、荧光显微镜、尖头吸管等。
首先，将样品吸到尖头吸管的尖端，然后涂上荧光染料，必要时可以用位置标记追踪样品的位置。
待置于荧光显微镜下，借助紫外光照射观察并识别样品。
荧光染色法有很多优点，如能够在体内和环境中快速准确诊断真菌感染，在判别不同类型的真菌方面准确性高，同时还能够在遵循标准操作过程的情况下、在较大范围内检测样本。
荧光染色法在浅部真菌检查中的应用非常广泛，包括对皮肤、毛发、指甲等浅部组织进行快速定位和细胞分析。
荧光染色法还可以用于检测带状疱疹病毒、病毒性角膜炎等感染。
总之，荧光染色法在浅部真菌检验中的应用非常广泛，能够快速、准确地确定真菌感染的性质和严重程度，并能够指导临床治疗和预防工作。
几种常用特殊染色操作过程中的要点
一、网状纤维染色 ——氢氧化银氨法（Gomori法）
5
（一）网状纤维的形态结构
较细的纤维组织、短、分支多，交织成网状
（与胶原纤维共同为细胞丰富的器官起到支撑作用）
HE呈淡红色，银氨液浸染、甲醛还原后呈黑色
（嗜银性/嗜银纤维：黑色）
主要由Ⅲ型胶原蛋白构成，表面被覆糖蛋白
（PAS染色：淡紫红色）
6
＋蒸馏水，洗涤沉淀（50-100ml蒸馏水） <反复/3次，沉淀不浑浊>
留下沉淀及少许上清液（4ml）
<保留沉淀物质>
逐滴＋氢氧化铵（一次1-2滴加入）
<边加摇晃>
至沉淀逐渐完全溶解
<无色溶液>
逐滴＋10%硝酸银，至刚出现浑浊 加氢氧化铵一至数滴，使沉淀消失
＋蒸馏水至40ml，2-8°C冰箱
<浑浊状态>
2
四、淀粉样物 刚果红法（甲醇刚果红、碱性刚果红）、甲基紫法 五、色素 含铁血黄素（Perls）、黑色素（Masson-Fontana）铜（罗 丹明、红氨酸） 六、糖类物质 糖原（PAS）、黏液物质（AB-PAS、AB） 七、脂内物质 中性脂肪（苏丹Ⅲ、Ⅳ、油红O）
3
八、神经组织 尼氏体（硫瑾、甲苯胺蓝）、神经髓鞘（变色酸2R、砂罗 铬花青） 九、肝脏穿刺 Masson、网状纤维、含铁血黄素、PAS、铜等。 十、肾脏穿刺组织 Masson、六胺银、PAS、刚果红等
1.氧化（KMnO4）：使网状纤维内羟基转变为醛基。<选择性> 2.漂白（H2C2O4）：棕色变为无色。 3.媒染（铁明矾）：增加网状纤维对银氨液的选择性。 4.浸银（氢氧化银氨）：银氨液中Ag（NH3）2+被组织吸附后与醛基结合。 5.还原（甲醛）：与网状纤维结合的银氨配位化合物还原成黑色的金属 银。
荧光染色法在浅部真菌检验中的应用
荧光染色法在浅部真菌检验中的应用1. 引言1.1 荧光染色法简介荧光染色法是一种通过荧光显微镜观察细胞、组织或微生物的染色技术。
它利用荧光标记的探针与待检测物结合，然后利用荧光显微镜观察标记物的荧光发射情况，从而获得待检测物的信息。
荧光染色法具有高灵敏度、高分辨率和高特异性的优点，被广泛应用于生物医学领域。
在浅部真菌检验中，荧光染色法也发挥了重要作用。
由于浅部真菌常常难以在常规染色方法下被检测到，而荧光染色法能够提高检测的灵敏度和特异性，因此成为检测浅部真菌的重要手段。
荧光染色法在浅部真菌检验中的应用不仅可以帮助医生准确诊断疾病，还可以指导药物治疗和预防措施的制定。
2. 正文2.1 浅部真菌检验的重要性浅部真菌检验是临床医学中常见的实验室检测项目，其重要性不言而喻。
真菌是一类微生物，包括酵母菌和霉菌等，它们常常是引起各种疾病的致病因素。
浅部真菌感染常见于皮肤、指甲、毛发等表面，常见症状包括瘙痒、疼痛、红肿等。
及时准确地进行浅部真菌检验，对于诊断和治疗真菌感染至关重要。
浅部真菌检验的重要性主要体现在以下几个方面：浅部真菌感染可能会引起大片皮肤损害，严重影响患者的生活质量。
及时检测出真菌感染的病因，有助于医生采取正确的治疗措施。
有些真菌感染症状常常与其他皮肤病相似，容易误诊误治。
通过浅部真菌检验，可以明确病因，避免不必要的治疗。
一些患者免疫系统较弱，容易患上真菌感染。
浅部真菌检验可以帮助医生及早发现患者的真菌感染情况，采取有效的治疗措施，减少感染的风险。
浅部真菌检验的重要性不容忽视。
只有通过准确的检验结果，医生才能做出正确的诊断和治疗方案，确保患者能够及时康复。
2.2 荧光染色法在浅部真菌检验中的原理荧光染色法在浅部真菌检验中的原理是利用荧光染料特定的发光性质，将其与真菌细胞中的特定组分结合，通过显微镜观察荧光信号来识别和定量目标真菌。
荧光染色法的原理基于荧光染料在特定光波长下的激发和发射现象，一般使用激光或是特定波长的光源来激发荧光染料，然后观察目标物体发出的荧光信号。
真菌的形态观察与革兰氏染色
实验、真菌的形态观察与革兰氏染色一、目的1、学习并掌握酵母菌和霉菌形态结构的观察方法；2、加深理解酵母菌和霉的形态特征。
3、巩固显微镜(油镜)的使用方法。
二、试剂与器材1.材料菌种：啤酒酵母、霉菌装片2. 仪器及相关用品：显微镜，香柏油，二甲苯（或1﹕1的乙醚酒精溶液），擦镜纸、吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液。
3、G+和G-菌种三、内容1、酵母菌形态和无性孢子的观察2、霉菌形态和无性孢子的观察，由菌丝（hypha）和孢子（spore）组成，菌丝与孢子交织在一起。
各种霉菌的菌丝和孢子形态不同，是鉴别真菌的重要标志。
3、革兰氏染色简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检步骤（1）涂片：取一洁净载玻片，滴一小滴生理盐水于玻片中央，按无菌操作要求，先用接种环，挑取少量某菌培养物于玻片中央水滴中，涂布均匀。
要求涂片薄而均匀。
使其自然干燥。
（2）干燥、固定：涂片干燥后，快速通过火焰2-3次，进行固定。
固定时不可过热。
以载玻片不烫手为宜。
（3）染色：a)初染：滴加结晶紫染色液覆盖玻片涂布区，染色1分钟，用水冲洗。
b)媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并覆盖1分钟，水洗。
c)脱色：甩净载玻片上水分，倾斜玻片，并衬以白纸，用95%乙醇滴洗至无紫色褪下时为止，时间20-30S。
立即用水缓缓冲洗，注意脱色时间不可过长，以免呈现假阴性。
d)复染：滴加番红染色液，染色3-5分钟，水洗。
（4）镜检：待其自然干燥，镜检。
五、关键及注意事项1、使用油镜后要用二甲苯清洗高倍镜头；2、涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀；3.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落；4、革兰氏染色各步骤的时间控制；特别是脱色时间的控制。
六、作业简述染色结果，并指出革兰氏染色的关键步骤，为什么要进行复染？。
丛枝菌根真菌孢子染色法
丛枝菌根真菌孢子染色法丛枝菌根真菌孢子染色法是一种常用的技术，用于研究丛枝菌根真菌的孢子形态和生活史。
本文将深入探讨丛枝菌根真菌孢子染色法的原理、步骤和应用，并分享个人对该技术的理解和观点。
1. 丛枝菌根真菌孢子染色法介绍丛枝菌根真菌是一类与植物根系共生的真菌，其特征是形成复杂的菌根结构，提供水分和养分供给宿主植物。
研究丛枝菌根真菌孢子的形态和生活史对于理解其生态学特征和共生机制具有重要意义。
而丛枝菌根真菌孢子染色法则是研究这些孢子的常用技术之一。
2. 丛枝菌根真菌孢子染色法的原理丛枝菌根真菌孢子染色法主要基于格拉姆染色法的原理。
格拉姆染色法是一种将细菌染色并分为两类的技术，结果为紫色格拉姆阳性菌和红色格拉姆阴性菌。
在丛枝菌根真菌孢子染色法中，常用的染色剂是格拉姆染色液、洗涤液和甲醛等。
3. 丛枝菌根真菌孢子染色法的步骤丛枝菌根真菌孢子染色法的步骤通常包括以下几个主要环节：步骤一：准备样品需要从土壤或植物根际采集丛枝菌根真菌的菌丝或孢子样品。
样品的选择和处理对于后续的染色过程非常重要。
步骤二：固定样品将样品固定在载玻片上，使用适当的固定液，例如甲醛，使菌丝或孢子保持形态稳定。
步骤三：染色将固定的样品在格拉姆染色液中染色，根据染色时间的控制可以得到不同程度染色的效果。
步骤四：洗涤用洗涤液对染色后的样品进行洗涤，去除多余的染色剂。
步骤五：显微镜观察和拍照将样品放置在显微镜下观察，根据需要进行拍照或记录。
4. 丛枝菌根真菌孢子染色法的应用丛枝菌根真菌孢子染色法在丛枝菌根真菌研究中有着广泛的应用。
它可以用于鉴定不同类型的丛枝菌根真菌，了解其孢子形态和生活史。
该技术还可以用于其他相关领域的研究，如生态学、土壤微生物学等。
5. 个人观点和理解丛枝菌根真菌孢子染色法是一种非常有用的技术，可以帮助我们深入了解丛枝菌根真菌的生态学特征和共生机制。
通过染色和显微观察，我们可以观察到孢子的形态特征，进而进行分类和鉴定。
荧光染色法在浅部真菌检验中的应用
荧光染色法在浅部真菌检验中的应用荧光染色法是一种用来检测真菌菌丝和孢子的方法，它通过特殊的染料和荧光显微镜来观察样本中的真菌结构和特征，从而使得真菌的存在和数量变得可见。
使用荧光染色法进行真菌检测对于浅部真菌感染的诊断和治疗具有重要意义。
荧光染色法中最常用的染料是荧光素（calcofluor white），它可以在特殊的波长下发出蓝色荧光。
对于主要成分是纤维素和几丁质的真菌细胞壁，荧光素呈现出强烈的亲和性。
使用荧光素染色的样本在荧光显微镜的蓝色激发光下，真菌细胞壁就会发出绿色的荧光。
这种荧光信号可以清晰地显示出真菌的位置、形态和数量，从而方便检测和诊断。
荧光染色法的操作过程比较简单，主要包括制备样本、染色和观察三个步骤。
制备样本时，需要采集病人体内分泌物、组织、血液等样本，并在荧光素溶液中进行适当浓度的稀释。
然后，在荧光素溶液中加入样本，并在荧光显微镜下观察真菌的信号。
荧光染色法的应用范围比较广泛，特别是在浅部真菌检测方面，其作用更为重要。
浅部真菌感染是一种常见病，可分为表皮真菌和微生物真菌两类。
表皮真菌感染通常包括足癣、股癣、手癣等多种疾病。
而微生物真菌通常是指真菌对人体各个器官的感染，如口腔白色念珠菌病、肺隐球菌病、念珠菌性皮肤角化症等。
在浅部真菌检测中，荧光染色法有着良好的应用效果，其优势主要有以下几点：1.对样本的灵敏性高。
荧光染色法能够迅速、准确地检测出真菌的存在和数量，能够有效地应对疑难病例的诊断。
2.检测速度快。
荧光染色法的操作简单，检测速度快，在临床上非常适用。
3.荧光信号明显。
荧光染色法所得到的荧光信号清晰明显，不需要使用复杂的显微镜，能够明确地显示出真菌的位置、形态和数量，减少全息考量的误差。
总之，荧光染色法在浅部真菌检测中是一种可靠的检测方法，其优点包括灵敏性高、检测速度快、信号明显等，能够有效地指导临床诊断和治疗，对病人的康复具有重要意义。
皮肤真菌免疫荧光染色
皮肤真菌免疫荧光染色1. "小王，你知道为啥咱们实验室的显微镜晚上会发出五颜六色的光吗？"老李一边整理样本一边笑着问道。
"这可是咱们皮肤科最神奇的检查方法之一！"2. "这个皮肤真菌免疫荧光染色啊，就像是给真菌们打上了荧光标记，让它们在黑暗中自己暴露身份。
简直比破案还有意思！"3. "你看这个病人的皮屑样本，咱们先用特制的抗体，就像是给真菌穿上了会发光的小马甲。
这些抗体特别挑剔，只认自己的真菌老朋友。
"4. "染色过程可讲究了，得按步骤来。
先把样本固定好，就像是让真菌们站好队。
然后加入抗体，等着它们慢慢相认。
这就跟相亲似的，得给够时间。
"5. "小王插嘴问：'师傅，那为啥有的样本发绿光，有的发黄光啊？'老李眼睛一亮：'这就是最有意思的地方了！不同的真菌染上不同的荧光抗体，就会发出不同颜色的光。
'"6. "比如说，皮肤癣菌发出亮绿色的光，像个小夜明珠。
而念珠菌就喜欢发黄光，跟萤火虫似的。
这样咱们一看颜色就知道是哪路神仙来了。
"7. "不过啊，这活儿可不是那么好干的。
温度要控制得刚刚好，就像煮饺子一样，火候过了或不够都不行。
室温二十度最合适，高了低了抗体都不乐意工作。
"8. "还有清洗这一步，得像洗衣服一样仔细。
把没结合的抗体都冲走，要不然就会出现假阳性，那可就闹笑话了。
"9. "最神奇的是观察的时候。
咱们关掉普通灯光，打开荧光灯，那个场面，简直像是在看星空一样漂亮。
真菌在显微镜下闪闪发光，美得不得了！"10. "这方法比传统培养可强多了。
培养得等一两周，这个最快两小时就能出结果。
而且准确率特别高，真菌想躲都躲不掉。
"11. "不过也得提醒你啊，做这个检查的时候可得戴好防护。
乳酚棉蓝(LPCB)：真菌染色的原理和步骤
乳酚棉蓝（LPCB）：真菌染色的原理和步骤乳酚棉蓝（LPCB）湿式安装是真菌染色和观察最广泛使用的方法。
原理
LPCB是用于半永久性显微镜制备真菌的染色剂。
LPCB污渍具有以下三个成分：苯酚：杀死任何活生物体。
乳酸：保留真菌结构。
棉蓝：深染真菌细胞壁的几丁质和纤维素。
程序
1.将70％的乙醇滴在干净的显微镜载玻片上
2.将标本浸入一滴酒精中
3.在酒精变干之前，添加一滴或最多两滴LPCB
4.握住食指和拇指之间的盖玻片，用盖玻片的边缘接触固定剂液滴的一个边
缘，然后轻轻降低以免产生气泡
5.现在准备检查该准备
6.使用低功耗物镜进行初始检查。
切换到更高功率（40X）的物镜以更详细地
检查孢子和其他结构
结果
LPCB安装座上的曲霉菌。
曲本利兰真菌染色改良法
曲本利兰真菌染色改良法摘要目的:使标本具有形态结构完整性,并且具有较长时间保存。
方法:直接接种培养和直接染色并且同时封片。
结果:颜色鲜艳,真菌孢子不易脱落,菌丝和孢子具有保持自然形态,同时具有封片保存功能。
结论:方法操作简便、易把握。
由于染色液内具有粘合性作用,使着色和封片同时进行。
关键词真菌;小培养;聚乙烯醇;曲本利兰真菌由菌丝和孢子构成,孢子是真菌的生殖结构,分为有性孢子和无性孢子,真菌分为浅部真菌和深部真菌。
根据真菌特殊的菌丝和孢子形态来确定真菌的种类。
真菌的种类很多,在自然界分布极广,它的形态结构复杂,菌丝体和孢子的形态特征随真菌种类不同而异,是鉴别真菌的重要依据。
真菌标本其目的主要是在于真菌的形态结构完整性和着色清晰而又长久保持鲜艳,为了提高教学质量,本作者在原有几种方法基础上作了一些改进。
1材料与方法1)菌种:青霉菌、黄曲菌、毛霉菌、孢子丝、等,以上菌种均为本实验室保存提供。
2)染色液的配制:A液:①聚乙烯醇(PV A-124)3.6g,②蒸馏水50ml。
(将①加入20度冷蒸馏水中搅拌逐步加温到95度);B液:①石碳酸25ml;②乳酸25ml;③曲本利兰0.5g(将①、②、③混合溶解),染色时将A液B液等量混合。
聚乙烯醇溶解时,可边搅拌边将本品缓缓加入20℃左右的冷水中充分溶胀、分散和挥发性物资的逸出(切勿在40℃以上的水中加入该产品直接进行溶解,以避免出现包状和皮溶内生现象),而后升温到95℃左右加速溶解,并保温2～2.5小时,直到溶液不再含有微小颗粒,再经过28目不锈钢过滤杂质后,即可备用。
3)沙保弱培养基:①葡萄糖4g;②蛋白胨2g;③琼脂1.8g;④蒸馏水100ml将①、②、③、④、混合放置150ML三角烧瓶内包扎好瓶塞,高压蒸汽10磅10min灭菌。
本培养基不需校正pH。
本培养基是真菌常规本培养基。
4)小培养法:在无菌条件下,用无菌毛细滴管吸取已融化的沙保弱培养基,快速地放入已消毒的盖玻片上1滴,等凝固后用无菌接种针取真菌菌种少许穿入培养基中,然后将盖玻片的标本反过来放入已消毒的载物玻片中,然后,将此片子放入干净的培养皿中,培养皿底部放入潮湿的吸水滤纸,或者将培养皿底放入一些水,中间用玻璃棒隆起,将做好的培养片子搭放在上面,在25℃～28℃温箱培养,在72-96h取出染色。
几种常用特殊染色操作过程中的要点
＋蒸馏水，洗涤沉淀（50-100ml蒸馏水） <反复/3次，沉淀不浑浊>
留下沉淀及少许上清液（4ml）
<保留沉淀物质>
逐滴＋氢氧化铵（一次1-2滴加入）
பைடு நூலகம்<边加摇晃>
至沉淀逐渐完全溶解
<无色溶液>
逐滴＋10%硝酸银，至刚出现浑浊 加氢氧化铵一至数滴，使沉淀消失
＋蒸馏水至40ml，2-8°C冰箱
<浑浊状态>
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3.高锰酸钾氧化时间不可过长，过长容易影响组织细胞形态的观 察。 4.原法中甲醛还原后用0.2%氯化金调色、5%硫代硫酸钠固定及VG 液复染，实际工作中可省略。（不进行复染结果对比同样清晰） 5.根据诊断的需要，可进行与其他（如+Masson）染色套染。
17
（七）染色结果
网状纤维—黑色 胶原纤维—黄色至棕黄色 胞核—褐色
9
（五）染液的配制及保存
①0.25%高锰酸钾：（定期更换）
②2%草酸：
③2%硫酸铁铵： ④Gomori银氨液：（使用、保存几周）
棕色瓶 2-8°C冰箱保存
（染色成败的关键）
⑤4%中性甲醛：（定期更换）
10
Gomori银氨液-1
10%硝酸银(3ml)+10%氢氧化钾(1ml)
<出现棕黑色颗粒沉淀>
（溶解度0.4%），溶于酒精（溶解度7.6%）。
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（四）染液的配制及保存
①5%苯酚水溶液：（临时配制）
先在恒温箱中加热溶解，吸取5ml与95ml蒸馏水混合配制。
②苯酚碱性品红液：（保存期1年）
碱性品红 无水乙醇 5%苯酚水溶液
0.5-1g 溶解
真菌荧光染色液
真菌荧光染色液的主要成分和作用机制
主要成分
真菌荧光染色液主要包含荧光素、多聚甲醛、氯化汞、蔗糖 等成分。
作用机制
多聚甲醛固定细胞，氯化汞增加细胞通透性，荧光素与真菌 细胞内结构结合，在紫外光的激发下产生荧光信号，可直接 观察到真菌细胞结构。
02
真菌荧光染色液的特点
高灵敏度和高特异性
真菌荧光染色液采用荧光染色技术，具有高灵敏度和高特异 性，可以有效检测和鉴定各种真菌。
可以用于检测和鉴定真菌的种类、数量、生长状态等，提供 全面的真菌相关信息。
对环境和样品无污染
真菌荧光染色液采用安全无毒的染料和溶剂，对环境和样 品无污染，符合环保要求。
与传统染色方法相比，真菌荧光染色液避免了使用有害试 剂和废液排放等问题，更加安全可靠。
03
使用方法
样本制备
样本采集
选择新鲜、无污染的疑似含有真菌的样本进行采集。
流行病学调查
通过检测患者或人群中是否存在真菌抗原，对真菌感染的流 行病学进行调查和研究。
农业领域
农产品检验
对农产品表面进行真菌荧光染色，检测有无真菌污染，保障食品安全。
农业生态环境监测
通过检测土壤、水源等环境中真菌种类和数量，评估生态环境的质量。
环境监测领域
水质监测
对水样进行真菌荧光染色，检测水中是否存在有害真菌，评估水质状况。
大气污染监测
通过检测大气中真菌数量和种类，评估空气质量及大气污染程度。
工业领域
产品质量控制
在工业生产中，对原料、半成品和成品进行真菌荧光染色， 检测有无真菌污染，确保产品质量。
工业废水处理
对工业废水进行真菌荧光染色，检测废水中有无有害真菌， 保障废水处理效果。
真菌荧光染色 操作规程
真菌荧光染色操作规程
【真菌荧光染色液】一种快速检测真菌的试剂，检测范围广，阳性率高，远优于传统湿片法，临床上毛囊炎糠秕孢子，马拉色菌的检测湿片法基本无效，而荧光法可敏感快速的检测出来，医保收费，需使用荧光显微镜。
取样→滴加一定浓度的KOH 溶液→经酒精灯加热固定→光学显微镜观察
取样→
滴加荧光染
色液→加盖
盖玻片→荧
光显微镜观
察
操作同样简洁，需要时间短，适
用于临床大样本，快速检测。
找到真菌菌丝或者孢子结构，得出结果根据看到荧光标
记的真菌菌丝或者孢子结构，得出结果
可以明确明辨糠皮孢子感染、马拉色菌感染(检查糠皮孢子的派克墨水法敏感度更高，不用加热环节，有利于临床实际应用。
)。
真菌孢子染色方法
真菌孢子染色方法
真菌孢子染色是一种常用的方法，用于识别和鉴定真菌的孢子。
下面是一种常见的真菌孢子染色方法：
1. 准备菌落：将要研究的真菌培养在富集营养的琼脂平板上，培养至菌落充满整个平板。
2. 准备玻片：在干净的玻片上滴上一滴蒸馏水，然后用火焰轻轻烘烤玻片以消毒。
3. 取菌悬液：用无菌的铁环或棉签在菌落表面刮取一些真菌，将其悬浮于滴有蒸馏水的玻片上。
4. 固定菌悬液：将玻片固定在火焰上加热，使液体迅速蒸发。
这会使真菌细胞固定在玻片上。
5. 染色：将固定的真菌细胞涂上适当的染色剂，如甲基蓝或利马胭脂红。
让染色剂在细胞上停留一段时间，以便使孢子吸收染色剂。
6. 清洗：用蒸馏水轻轻将染色剂洗掉，直到水洗干净。
7. 除染：将玻片置于75％酒精溶液中，脱色5-10秒钟。
然后
将玻片漂洗至完全去除染色剂。
8. 干燥：将玻片倾斜放置于无菌条件下，自然晾干。
9. 观察：在显微镜下观察玻片上的真菌孢子，记录和描述它们的形态特征。
需要注意的是，不同真菌的孢子可能具有不同的染色特性，染色条件和方法可能会有所变化。
因此，在使用此方法前，最好根据具体的研究对象进行细菌孢子染色的相关文献咨询和验证。
棉兰染色-张健东
临床意义
• 橘青霉可引起肾脏的损害，有弱致癌性； • 绳状青霉可引起大米变质并引起中毒； • 马尔尼菲青霉引起皮肤结节，皮下脓肿及
网状内皮系统感染，预后凶险。
链格孢属
培养特性 SDA培养基上28℃培养，生长迅速，形成棉絮状， 后变为绿褐色至深褐色，背面为黑色。
镜下形态
——分生孢子梗直立，暗色，分隔，单生或分枝状。分生孢子 砖格状，倒棍棒状，有尖，光滑或粗糙，水平，垂直，或斜形 分隔。
真菌真菌镜检染色 - 乳酸棉兰酚染色
天津市第三中心医院
检验科 张健东
1. 真菌标本的接种
2. 培养基选择
3. 常用染色方法
4. 曲霉菌属镜下形态和菌落特点 5. 病例分析
医学重要的霉菌分类
合格痰标本
• 含1-2种不同细菌，可考虑 继续培养，结果可根据病 情再作分析 • 超过3种细菌，按不合格 标本处理。
显微镜检查方法
• 乳酸酚棉兰染色：通常采用透明胶带法
– 利用胶带先粘一定量菌丝 – 再粘在预先滴加乳酸酚棉兰的载玻片上
– 显微镜下观察孢子和菌丝的形态、特征、大小 和排列等。
显微镜检查方法
• 六胺银染色
– – – – 涂片（痰需消化，无菌液体离心）甲醇固定后自然风干 过碘酸滴染10分钟，溶液用后弃去 流水冲洗（3遍） 65℃银溶染液1h-1.5h染色时间根据涂片的厚度所怀疑真菌的种类，通常念珠菌染 色1h即可，疑为曲霉或者其他丝状真菌须适当延长染色时间（银溶液需现用现 配，只用一次） 流水冲洗（3遍） 0.25%的氯化金染1到2分钟（可重复使用） 流水冲洗 3%的硫代硫酸钠染1分钟 流水冲洗 0.1%的亮绿染色30秒到1分钟 目的使得到一个背景色
烟曲霉菌落, PDA, 25℃, 7d
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、概述真菌是指具有真正细胞核、产生孢子、不含叶绿素，以寄生或腐生方式吸取养料，能进行有性和(或)无性繁殖，具有纤维素(或其他葡聚糖)或几丁质的微纤维或两者兼有的细胞壁的有机体。
真菌侵犯人体常继发于其他疾患，如恶性肿瘤、TB、糖尿病等慢性消耗性疾病；大剤量X线照射；免疫抑制剂等导致免疫功能和抵抗力低下；大量应用肾上腺皮质激素的病人，其炎症反应多受抑制，也容易感染真菌；另外器官移植、导管插管、放疗等应用引起局部组织损伤，为真菌的入侵提供了条件．近年来由于免疫缺陷病毒感染者的不断出现，使原来不致病的真菌转为致病真菌。
因此，真菌感染已经成为一个日益严峻的问题。
真菌分为浅部真菌和深部真菌。
浅部真菌：主要侵犯机体皮肤，寄生和腐生于表皮，毛发和甲板的角质组织中，引起浅部真菌病，简称癣病。
临床最多见的浅部真菌病有：体癣、股癣、手癣和足癣。
深部真菌：指侵犯表皮以外组织和器官的病原菌和条件致病真菌.；按生物学性状的不同又分为：酵母型、酵母样型、丝状菌型、双相型。
深部真菌常见的有：念珠菌，隐球菌，组织胞浆菌,马尔尼菲青霉菌，曲霉，毛霉菌,孢子菌丝等。
二、常见真菌的形态特征真菌的大小差异悬殊，大者如碗口，不属微生物范畴，例如灵芝；小者肉眼看不到，只能用显微镜观察。
真菌的形态分单细胞和多细胞两种类型，单细胞真菌呈圆形或卵圆性，常见于酵母菌和酵母样菌；多细胞真菌多呈丝状，分枝交织成团，也称为丝状菌，即一般通称为霉菌。
三、真菌的基本结构真菌由菌丝和孢子构成。
孢子是真菌的生殖结构，分为有性孢子和无性孢子。
在适宜条件下，菌丝是由孢子生出芽管，逐渐延长呈丝状，生物学上把真菌的每一根细丝叫做菌丝。
四.真菌的染色方法真菌用H-E染色一般着色不良，因此需用特殊的染色方法来显色，六胺银法（GMS）用铬酸氧化真菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基还原六胺银内的银离子为黑色的金属银而显色。
PAS法用高碘酸氧化真菌菌壁的多糖游离出醛基，后者与无色品红结合生成新的品红色复合物而被显色。
这两种方法可显示大多数真菌，是最广泛最常用的染色方法。
近年来，有报道用网状纤维的染色方法（G-S）来显示真菌，特别是曲球菌的染色显示效果较佳。
现对常见的几种真菌作以下三种染色方法进行探讨。
（一）六胺银染色方法(GMS)1.操作方法：⑴切片脱蜡至水。
⑵8%铬酸水溶液氧化20分钟，自来水稍洗。
⑶0.5%偏重亚硫酸钠液处理1分钟，流水冲洗5分钟，再用蒸馏水洗2次。
⑷浸入已预热（约15-30分钟）的六胺银工作液中分三种方式处理：①水浴锅内恒温处理（50-52℃）：先将已盛有六胺银工作液的5片装高身染色缸置入水浴锅内预热15-30分钟，再将处理好的玻片置入六胺银工作液中反应30-60分钟，中途显微镜观察，至见到菌丝呈黑褐色为止。
②电热恒温箱内处理（58℃-60℃）：方法同上，在六胺银工作液中反应的时间较长需60-90分钟, 蒸馏水稍洗.③微波炉滴染：取微波炉专用蒸盒，底放50ml水，用于吸热保湿；玻片放置隔层，滴加六胺银工作液于组织上，火力3档5-6分钟,蒸馏水稍洗.⑸滴加0.1%氯化金溶液调色2-3分钟,蒸馏水洗。
⑹3%硫代硫酸钠液处理2-5分钟, 流水冲洗5分钟。
⑺用橙黄G复染1-2秒（首选）或用Mayer氏苏木素浅染，伊红复染。
⑻常规脱水透明封片。
2．染色结果：各种真菌均被着色，菌丝和孢子呈明显的黑褐色。
背景为：橙黄色（橙黄G复染），红色（伊红复染）。
※3．注意事项：六胺银染色是显示真菌效果最佳的一种方法，为了获得菌体及背景清晰的染色效果，首先必须做好准备工作，染色过程需用的玻璃器皿要洁净，尽量避免使用过久的蒸馏水配制试剂，建议使用双蒸水，这样才能保证六胺银工作液的纯度，避免杂质沉淀影响观察。
其次病理技术人员应掌握常见真菌的一般形态特征，并根据实验室的具体情况选择合适的孵育条件，摸索孵育时间和温度。
在显微镜下观察染色程度时，低倍镜下颜色不要太黑，至深棕褐色即可，经0.1%氯化金溶液调色后，真菌从深棕褐色变成棕黑色，真菌壁和孢子着色。
4．过染的补救措施：可用1%铁氰化钾与2%硫代硫酸钠1:1混合备用，临用时将此混合液再稀释2-3倍，滴入玻片上使组织减色，镜下观察。
（二）高碘酸—无色品红(PAS) 法1．操作方法：(1) 切片脱蜡至水。
(2) 0.5%高碘酸氧化5-8分钟。
(3) 流水冲洗2分钟，再用蒸馏水洗。
(4) 入无色品红液于暗处并加盖作用10-20分钟。
(5) 0.5%偏重亚硫酸钠液滴洗2次，每次约1分钟。
(6) 流水冲洗5分钟。
(7) 0.2%亮绿水溶液复染。
(8) 稍水洗。
(9) 常规脱水透明封片．2．染色结果：真菌菌丝和孢子呈品红色，其他组织绿色3．注意事项：无色品红液(Schiff氏试剂)的试剂配制主要是试剂的纯度要高，才能配制出理想的无色品红液，染色才能成功。
（三）银氨液浸染法（G-S法）1.操作方法：(1) 切片脱蜡至水(2) 切片滴入0.5%酸化高锰酸钾液，氧化5分钟，稍水洗。
(3) 2%草酸水溶液漂白1-2分钟，稍水洗。
(4) 2%硫酸铁铵水溶液媒染5分钟，再用蒸馏水洗一次。
(5) 滴入G-S氏银氨液作用10-30秒，蒸馏水稍洗。
(6) 10%中性甲醛液还原30秒，流水冲洗数分钟。
(7) 滴加0.1%氯化金溶液调色2-3分钟（镜下观察），水稍洗。
(8) 3%硫代硫酸钠液处理2-5分钟（镜下观察），流水冲洗5-10分钟。
(9) 核固红液复染5-10分钟，稍水洗，常规脱水透明封片。
2.染色结果：网状纤维及真菌呈棕黑色，胞核红色（核固红复染），胶原纤维黄棕色，胞质淡红色（伊红复染）。
3.注意事项：⑴配制银氨液的蒸溜水要纯，滴入银氨液作用不要超过1分钟，最好控制在10-30秒已足。
⑵ 10%中性甲醛还原不要超过1分钟，最好控制在30秒，否则容易出现银氨沉淀，影响观察。
五、几种真菌的显示特点1．新形隐球菌在镜下多呈圆形，直径为4-20微米，菌体周围有一层宽阔的具有折光性的胶质样荚膜包绕，荚膜厚3-5微米，为一种粘多糖物质所组成，爱先蓝染色和粘液胭脂红染色呈阳性反应。
六胺银染色也能很好地显示菌体的特征，但必须掌握染色程度，显色太浅，隐球菌的夹膜不明显，显色太深，则分不清夹膜和菌体。
2．组织胞浆菌病的感染途径是通过吸入荚膜型组织胞浆菌的分生孢子后感染所致的全身性真菌病，主要侵犯机体的网状内皮系统。
组织胞浆菌病是一种典型的双相性真菌，在人体组织中是酵母型，大部分病变中均可在巨噬细胞内找到很多的病原菌。
HE染色见菌体为小圆形或卵圆形，直径很小只有1-5um，有明显的细胞壁。
PAS染色（首选）菌细胞壁阳性。
六胺银染色也能清晰的见到病原菌，菌细胞壁呈黑色。
3．马尔尼菲青霉菌是较罕见的真菌病，是已知唯一的双相性青霉菌，该菌在人体组织中酷似组织胞浆菌，其镜下是一种2.5-3微米的圆形或椭圆形酵母细胞，它所具有的特征性标志是腊肠形分隔的孢子。
本病易与组织胞浆菌混淆，（1）组织胞浆菌在组织胞浆内呈淡蓝色核点，周围有空晕，但无“腊肠”状菌体、中部无横隔。
（2）马尔尼菲青霉菌有双相性，即在不同温度下培养呈不同形态。
25℃培养呈灰褐色绒毛状菌落，培养基呈玫瑰红色，镜下为菌丝相；37℃培养呈灰褐色粗糙的酵母样菌落，镜下为酵母相。
组织胞浆菌虽然也有双相性，但不产生红色色素。
六胺银染色（首选）可以很好地显示出它的特征，但要熟练掌握好温度和时间，建议用橙黄G复染，这样底色清晰，能更好的发现椭圆形或腊肠状的菌体,中央有一着色较深较粗的横壁。
马尔尼非青霉菌的淋巴结组织不适合选用银氨G-S染色方法；PAS染色也很难发现椭圆形或腊肠形分隔的孢子。
4．念珠菌为圆形或椭圆形生芽的酵母样菌，壁簿，由芽管延长而形成的假菌丝长而直，有分隔，少数有分枝，芽生孢子和假菌丝同时见到才可诊断为念珠菌，通常陈旧性病灶或病灶深部菌丝较多，而病灶浅部的孢子较多。
六胺银法和PAS法都能很好地显示出念珠菌的孢子和假菌丝。
5．烟曲霉的营养菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，在切片内有时可以清楚的看到孢子；分生孢子头短柱形，长短不一；分生孢子梗光滑，近顶端膨大形成倒立烧瓶状顶囊。
顶囊有单层小梗，较长，黑棕色密集排列呈栅状，布满顶囊表面4/5。
6．曲霉是较常见的一种真菌，营养菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成，粗细均匀，两侧菌丝壁平行，有横隔，常呈45度锐角分枝，呈放射状或珊瑚状排列。
曲菌常在组织空腔内大量繁殖，其菌丝缠绕在一起形成团块，称曲菌球。
六胺银法、PAS法和银氨G-S法染色都能很好地显示菌丝体，营养菌丝体着色较深，反之着色较浅。
7．毛霉菌主要侵犯肺，脑和其它器官,最常侵犯血管引起血栓形成和血道播散，毛霉菌菌丝粗大,壁厚，两侧壁不对称 ,宽窄不均,不分隔 ,菌丝偶有分枝而不规则,呈钝角或直角分枝,有时菌丝可呈直管状 ,有些又像枯枝状。
用六胺银法、PAS法和银氨G-S法都能很好地显示毛霉菌菌体。
8．放线菌按生物学分类属于细菌，有细胞壁，其化学组成与细菌相似；由于所引起的病变与真菌相似，故多把它归为真菌类介绍。
近年来，由于临床上大量使用广谱抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂及进行大量的放疗，其结果造成机体内菌群失调和菌群交替，使作为条件致病的放线菌引起的机会性感染发病率急剧上升。
放线菌的菌落由大量菌丝交织而成，周边部分菌丝成放射状排列，故称为放线菌。
H-E染色中可见放线菌丛（肉眼观察为硫磺样小颗粒）。
菌丛中央由交织成团的菌丝构成，呈紫蓝色，周边部分为放射状排列的菌丝未端，呈棒状膨大和红染。
革兰氏染色阳性。
六胺银染色能把菌丝和胶样鞘都显示出来。
放线菌常侵犯人的颈面部，腹部和胸部亦可侵犯肠壁、肝和肺。
六、三种染色方法的比较1. 六胺银染色①六胺银染色能显示大多数真菌,是显示真菌效果最佳的一种方法。
②本实验中的7种真菌和1种细菌染色效果都十分理想。
③六胺银染色能很好的将真菌特点显示出来。
④六胺银染色中的微波炉滴染方法由于大部分使用家用微波炉,不能控制温度,效果不稳定。
⑤六胺银染色操作虽然繁琐,技术要求较多，需要积累并不断总结经验，才能获得菌体及背景清晰的染色效果。
2．PAS染色①操作简单,时间短，不容易过染。
②能较好的显示大多数真菌,包括单细胞型和多细胞型真菌。
③个别真菌局部着色不良。
④建议做PAS染色时也做六胺银染色,有利于观察判断。
3．银氨G-S染色法①操作简单,时间短,只需十几分钟.②能显示大多数真菌（较适合染多细胞型真菌）。
由于大量的网状纤维影响观察，故不适合染淋巴结内真菌感染的切片。
综上所述，三种染色方法各有利弊，其中六胺银染色是显示真菌效果最佳的一种方法，并且能显示另外两种方法所不能显示的真菌结构，对真菌病的诊断具有确诊的价值。