对峙间隔法诱导培养对放线菌抑菌活性的影响

对峙间隔法诱导培养对放线菌抑菌活性的影响

张辉;刘秋;于基成;楚文颖;任淑东;张建方

【摘要】目的评价间隔诱导培养对放线菌抑菌活性的影响.方法采用间隔诱导培养技术,分别以酵母菌、细菌和真菌作为诱导菌株,与22种放线菌分别进行间隔诱导培养,以真菌、革兰阳性菌以及革兰阴性菌作为活性评价指示菌,评价诱导后放线菌抑菌活性的变化规律.结果以真菌和革兰阳性菌为指示菌时,细菌和真菌两种诱导菌可更好地诱导放线菌抗真菌和抗革兰阳性菌活性;以革兰阴性菌为指示菌时,酵母菌可更好地诱导放线菌抗革兰阴性菌.结论当放线菌株和不同的诱导菌进行诱导培养后可以促进某些放线菌活性次生代谢产物(如抗生素)产量明显提高.

【期刊名称】《中国抗生素杂志》

【年(卷),期】2015(040)008

【总页数】6页(P579-583,589)

【关键词】放线菌;对峙间隔诱导培养;抑菌活性

【作者】张辉;刘秋;于基成;楚文颖;任淑东;张建方

【作者单位】大连民族学院,生命科学学院,大连116600;大连民族学院,生命科学学院,大连116600;大连民族学院,生命科学学院,大连116600;大连民族学院,生命科学学院,大连116600;大连民族学院,生命科学学院,大连116600;大连民族学院,生命科学学院,大连116600

【正文语种】中文

【中图分类】R379.1

放线菌是一类非常重要的药源微生物，其产生的很多次生代谢产物已被广泛地用作抗菌、抗病毒、杀虫和抗肿瘤药物。目前已发现的数万种微生物来源的生物活性物质中，约有45%是由放线菌产生的。因此，人们非常重视从不同的自然环境中分

离放线菌，并发酵培养各种放线菌以获取感兴趣的次级代谢产物，或采用基因诱变技术、重组技术提高传统或目前应用较广的抗生素产量。但经过多年的探索，从放线菌中发现新型活性代谢产物几率越来越低，严重制约着抗生素产业的发展。随着病原微生物对抗生素抗性的日益提高，发现新型抗生素或发明大幅度提高现有抗生素产量的新技术已迫在眉睫。

而微生物间的互利共栖、互惠共生、协同共栖、偏利共生等关系启发了人们通过利用微生物间的正向协同作用，提高活性代谢产物产量或诱导新活性物质的产生[1-2]。共培养技术又叫混菌培养或混合培养，是在深入研究微生物纯培养基础上的人工“微生物生态工程”。这些成功的事例很多，如利用“二步发酵生产维生素C”是混合发酵法应用的成功例子[3-5]；枯草芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌组合培养时

可以产生新的生物活性物质[6]；刘宏伟[7]对两种菌Acidithiobacillus ferrooxidans与Acidiphilium acidophilum共培养体系的协同作用及其生物浸出进行了研究。但上述报道利用的方法都是将两种菌液体混合培养。本文将两种菌在平板上对峙间隔诱导培养，利用双方的竞争、威慑或协同的诱导作用以提高诱导菌株抗菌活性，其结果将为开发提高抗生素产量新技术或发现新活性抗生素奠定基础。本文以22株放线菌为研究对象，以酵母菌、细菌以及真菌作为诱导菌株，与22

株放线菌分别进行诱导培养，以真菌、革兰阳性菌和革兰阴性菌作为活性评价指示菌，通过诱导培养后测定放线菌的抑菌活性变化，评价诱导菌对放线菌抑菌活性的影响。其结果将对开发诱导菌和放线菌的诱导培养体系，利用诱导菌提高现有放线菌抗生素产量或诱导新型代谢产物的产生奠定基础。

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株

菌株HVG56(Streptomyces griseoplanus) 等22株放线菌信息见表1(菌株编号

为采用培养基简写编号，如HVG56表示该菌株第一次是采用HVG培养基分离获得的第56号菌株，M95表示采用M培养基分离获得；DQ7表示采用淀粉琼脂培养基分离获得的7号菌株，GS表示采用高氏一号培养基等依此类推，全部为数字编号如4.223从中国普通微生物保藏中心购买菌株的菌种保藏中心编号)、黄瓜枯

萎病菌(Fusarium oxysporum)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大

肠埃希菌(Escherichia coli)、扣囊复膜孢酵母菌(Sccharomycopsis fibuligera)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)均来自大连民族学院功能微生物实验室。

1.1.2 培养基

LB培养基、PDA培养基、PD液体培养基配方见参考文献[8]。

1.2 实验方法

1.2.1 放线菌与3种诱导菌的活化培养

采用PDA和LB平板培养基分别活化22株放线菌菌株、诱导菌菌株和指示菌菌株。

1.2.2 放线菌与诱导菌的诱导培养

制备PDA平板培养基，将PDA平板分为五个平行区域，将放线菌与诱导菌对峙

间隔培养，最中间区域密集涂布诱导菌，依次密集涂布放线菌和诱导菌，如图1。涂布完成后，将平板于30℃培养1周。

1.2.3 指示菌的培养

采用PD液体培养基于25℃活化黄瓜枯萎病菌(F.oxysporum)，采用LB液体培养基于37℃活化金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠埃希菌(E.coli)，所有指示菌均培

养至对数生长期末期。

1.2.4 抑菌活性的测定

(1)含菌培养基的准备：将PDA或LB培养基溶化，待培养基温度降到适宜温度后，迅速把指示菌与PDA或LB培养基混合，制备含菌平板。

(2)抑菌活性测定：采用杯碟法进行放线菌抑菌活性测定[9]。分别以大肠埃希菌和

金黄色葡萄球菌为指示菌在37℃，培养4d；以黄瓜枯萎病菌为指示菌在28℃，

培养4d。测定与诱导菌诱导培养后各放线菌的抑菌活性变化，以不与诱导菌诱导

培养的放线菌的抑菌活性为对照，实验重复3次。

1.2.5 诱导率的计算

诱导率(%)=(诱导后放线菌抑菌圈直径-对照放线菌抑菌圈直径)/对照放线菌抑菌圈直径×100%

2.1 酵母菌诱导培养对放线菌抑菌活性变化

与酵母菌诱导培养后各放线菌菌株抑菌活性见表1。实验结果：与酵母菌诱导培养后，以真菌作为活性评价指示菌，评价放线菌抗真菌活性变化规律。22株放线菌中，其中4株菌株抗真菌活性明显提高，分别为M95、HVG、GSck-2和GQ17。其中，GQ17抗真菌活性提高最多，诱导率达186.7%，菌株GSck-2和HVG的

诱导率也分别高达120%和92.9%；其中6株菌株抗真菌活性明显降低，分别是HVG56、DQ7、MY09、T12-208、LQ39和LQ141；其中，12株菌株抗真菌活性没有变化。

以革兰阳性菌作为活性评价指示菌，评价放线菌抗革兰阳性菌活性变化规律。22

株放线菌中，只有菌株M95抗革兰阳性菌活性提高，但诱导率不高，只有12%；其中9株菌株抗革兰阳性菌活性明显降低，分别是HVG56、DQ7、HVGN4、GSck-2、4.576、HL9、4.567、T12-208和LQ141；其中12株菌株抗革兰阳性菌活性没有变化。以革兰阴性菌作为活性评价指示菌，评价放线菌抗革兰阴性菌活性变化规律。22株放线菌中，其中4株菌株抗革兰阴性菌活性明显提高，分别是HE16、4.567、LQ39、4.1059；其中12株菌株抗革兰阴性菌活性明显降低，分