固体组织蛋白提取.

固体组织蛋白提取

2017-07-18

固体组织蛋白提取

1. 每100mg固体组织剪碎后加入0.5 ml裂解液，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。注意：初始组织的量应在10-100mg范围。肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。

2. 取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，加2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。室温或4℃静置10分钟，偶尔晃动。注意：(1)组织量<10mg且静置时间短30min，在下一步离心时所形成的蛋白膜易碎，此时可静置30min。(2)提取脂肪组织时应4℃静置40min以上以充分去除油脂。

3. 10,000g 4℃离心10分钟，溶液分为两相，中间为蛋白膜。吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。蛋白膜将附着于离心管壁。注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。(2)如果初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入0.5-0.8ml纯乙醇混匀，10,000g 4℃离心5分钟。弃所有液体，蛋白沉淀在管底。

4. 敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。

5. 每100mg组织所得到的蛋白加 200ml用户自备的缓冲液，

95℃煮10分钟。室温放置20分钟溶解沉淀。注意：(1)可4℃过夜溶解沉淀，偶有少量不溶性组织纤维碎片可离心去除。(2)有时染色体DNA可与蛋白质一起被抽提出来，溶解时则形成粘稠物。延长95℃热变性时间、不时振荡、用注射针头反复抽吸，有助于彻底打断DNA。

3．样本组织RNA提取：取液氮保存的肺组织，研碎后加入RNAisoTMPlus，将研碎的样品完全覆盖，室温静置至样品完全融化，在研磨至裂解液呈透明状。移至离心管后加入l／5l埘AisoTMPlus体积量的氯仿，用力振荡后移至离心管中，室温静置 5min。12，000rpm／min 4 0C离心15min，取出离心管吸取上清夜，移入新的.离心管。向上清中加等体积的异丙醇，混匀后室温静置

10min。12，000rpm／min 4"C离心10min。弃取上清，加入75％的乙醇lml，洗涤管壁后12，000 rpm／min4。C离心5min，弃去乙醇。室温干燥沉淀5min 后加入适量RNase．free水溶解沉淀，完全溶解后置于--80℃ 保存。

4．按照试剂盒说明在微管中配制反应混合溶液，将提取的RNA),II入微管后70℃ 反应5min，离心收集。依试剂盒说明依次加入5×reaction buffer，Ribolock Ribonuclease inhibitor和10 mM Dntp mix，混匀后离心收集。置

于25℃5min。加入逆转录酶，然后置于25℃10min，再置于42℃60min，加热到70℃10m in停止反应。

组织剪碎，称重，加裂解液（含蛋白酶抑制剂）后匀浆，超声破碎也可以，注意要在冰上进行。然后12000转，10分钟，4度，离心取上清，测蛋白浓度，加loading buffer煮沸5-10分钟，做western

天根有一款样本保存液，能迅速渗入组织细胞，高效抑制RNase活性