固体组织蛋白提取.
细胞蛋白提取方法4页
细胞蛋白提取方法4页细胞蛋白提取是生物学研究中的一个重要步骤，可用于分离纯化目标蛋白质、检测蛋白质表达水平、研究蛋白质功能等。
本文将介绍四种常见的细胞蛋白提取方法，并分析它们的优缺点。
一、化学法化学法是最早使用的一种细胞蛋白提取方法。
其基本思路是将细胞破碎后，借助化学性质将蛋白质从细胞质中萃取出来。
1.酸性抽提法酸性抽提法最早用于提取细菌蛋白，后来逐渐应用于动物和植物细胞中，适用于水溶性蛋白。
操作时，将细胞用冷酸淀粉液破碎，使核酸和金属离子与蛋白质结合，然后用盐酸或硫酸调酸至pH3.5-4.0，离心沉淀细胞碎片，收集上清液并加入饱和的氨烷或三甲基乙酸酯，离心沉淀，洗涤并重悬。
优点：操作简单，适用于小规模提取。
缺点：易造成蛋白质的氨基酸脱羧、失活以及相互聚集等。
2.酒精沉淀法酒精沉淀法是利用酒精沉淀蛋白来提取细胞蛋白。
操作时，将细胞破碎，用氯化钠等盐类调节细胞液的离子强度，加入80%酒精沉淀蛋白质，沉淀后用70%酒精洗涤，除去脂肪和亲水性蛋白，最后重悬。
优点：适用于固体细胞组织和肌肉等纤维化组织，可提取胞外基质蛋白。
缺点：蛋白质失活易，不能提取不稳定蛋白质。
二、物理法物理法是利用物理力学原理将细胞破碎并萃取蛋白质。
这种方法适用于大量细胞的破碎和蛋白质的快速提取。
1.高压均质法高压均质法是传统的细胞蛋白提取方法。
操作时，将细胞悬液通入高压均质器，使之经过高压作用下击碎，高速剪切和磨擦等力作用，使细胞膜和核膜破裂，细胞内蛋白质释放出来。
优点：破碎效率高，提取速度快。
2.超声波破碎法超声波破碎法是近年来出现的一种物理法。
操作时，利用声波振动作用于细胞，使其中的蛋白质破碎并散布入溶液中。
优点：破碎效率高，可以提取水溶性和非水溶性蛋白，对蛋白质保护较好，适用于活性蛋白的提取。
缺点：超声波会产生热量和产生气泡，容易导致蛋白失活和降解，需要控制时间和频率。
三、生物法生物法是利用生物学原理将细胞破碎并清除细胞碎片。
提蛋白原理
提蛋白原理蛋白质是构成生物体的重要组成部分，也是维持生命活动的关键物质。
而提蛋白作为一种常见的生物化学技术，被广泛应用于生物医学研究、生物工程和制药工业等领域。
那么，提蛋白的原理是什么呢？首先，我们需要了解蛋白质的结构。
蛋白质是由氨基酸组成的长链状分子，它的结构具有多级层次，包括一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。
蛋白质的功能和性质取决于其结构，因此了解蛋白质的结构对于提蛋白至关重要。
提蛋白的原理主要包括蛋白质的溶解、分离和纯化。
首先是蛋白质的溶解，即将生物样品中的蛋白质溶解于适当的缓冲液中，使其保持天然的构象和生物活性。
其次是蛋白质的分离，通常采用凝胶电泳、色谱等技术，根据蛋白质的大小、电荷、亲疏水性等特性进行分离。
最后是蛋白质的纯化，通过各种手段将目标蛋白质从其他杂质中分离出来，得到高纯度的蛋白样品。
在实际操作中，提蛋白的原理还涉及到许多具体的技术和方法，如超声破碎、冷冻破碎、化学溶解等。
不同的样品和目标蛋白质可能需要不同的提取和纯化方法，因此在进行提蛋白实验时需要根据具体情况选择合适的技术路线。
除了以上提到的基本原理和方法，提蛋白的过程中还需要考虑一些其他因素，比如样品的保存和处理、实验条件的控制、纯化效果的检测等。
这些因素都会影响到提蛋白的效果和结果，因此在进行提蛋白实验时需要综合考虑，并严格控制每一个步骤。
总的来说，提蛋白的原理是基于蛋白质的结构和性质，利用化学、物理和生物学的方法将目标蛋白质从复杂的生物样品中分离出来，并得到高纯度的蛋白样品。
了解提蛋白的原理有助于我们更好地进行生物实验和研究，为生命科学和生物医学领域的发展做出贡献。
高脂肪样本蛋白提取方法
使用方法：
细胞蛋白提取： 1. 提取液制备：每 500ul 冷的蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物混匀后 置冰上备用。 2. 取 5-10×106 个细胞①，在 4℃，1000rpm 条件下离心 5-10 分钟，小心吸取培养 基，尽可能吸干，收集细胞。 3. 用冷 PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 每 5×106 个细胞中加入 500ul 冷的蛋白提取液，混匀后，在 4℃条件下振荡 15-20 分钟。 5. 在 4℃，14000rpm 条件下离心 15 分钟。 6. 将含有脂肪的上清吸入蛋白离心管中，套上液体收集管，在 4℃，12000rpm 条 件下离心 5 分钟。 7. 将液体收集管中的液体吸入另一预冷的干净离心管，即可得到蛋白样品。 8. 将蛋白离心管中的脂肪杂质用吸头或合适工具刮出，即可用于处理上步未处理
完的样品或其他待处理样品。 9. 将上述蛋白提取物定量②后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验③。
组织蛋白提取： 1. 提取液制备：每 500ul 冷的总蛋白提取液中加入 2ul 蛋白酶抑制剂混合物，混 匀后置冰上备用。 2. 取 100mg 组织样本剪碎，加入蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼 可见固体①。 3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在 4℃，10000rpm 条件下离心 5 分钟。 4. 将含有脂肪的上清吸入蛋白离心管中，套上液体收集管，在 4℃，12000rpm 条 件下离心 5 分钟。 5. 将液体收集管中的液体吸入另一预冷的干净离心管，即可得到蛋白样品。 6. 将蛋白离心管中的脂肪杂质用吸头或合适工具刮出，即可用于处理上步未处理 完的样品或其他待处理样品。 7. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
提取组织DNA操作详解
提取组织DNA1.用液氮研磨一定量的组织（约绿豆大小），在研磨的过程中尽量不要让组织直接暴露于空气中，以免组织坏死，造成DNA降解。
2.将研磨好的组织粉末集中于一处，加入500ul STE将粉末覆盖（50ug/500ulSTE)。
3.待研钵中物质化为液体时，将其吸入到1.5ml EP管，再加入75ul 10% SDS和6ul 10mg/ul 的蛋白酶K(proteinase K），混匀后放入56℃水浴箱中。
4.待组织样本完全消化后，加入500 ul平衡饱和酚（Tris-HCl饱和重蒸酚，PH:8.0），颠倒混匀 5 min,在4℃台式高速离心机中以5000g/min离心5min,离心完全后吸取上清液放入新EP管。
5.重复步骤4。
6.在新的上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比：24:1），颠倒混匀5min,在4℃台式高速离心机中以5000g/min 离心5min,离心完全后吸取上清液放入新EP管。
7.在EP管中加入1/10 体积的3mol/l 的NaAc 和2倍体积的冷无水乙醇，轻轻摇晃后放入-20℃冰箱，这时可看到絮状沉淀。
8.将静置后的液体在11000g/min 4℃10min 的条件下离心。
9.弃上清，加入1000ul 75％乙醇，将沉淀悬浮于乙醇中，然后在7500g/min 4℃5min 离心。
10.弃上清，将DNA沉淀晾干，以一定体积的TE溶解，一般以25-50ul TE溶解。
所需配制溶液STE（1L):需要高压灭菌，PH:8.0,其实就是0.1mol/L的TE●Tris base :1.21g(10mmol/L)●EDTA:0.37g(1mmol/L)●Nacl:5.84g(0.1mol/L)TE(250ul)：需要高压灭菌，PH:8.0●Tris base :0.30g(10mmol/L)●EDTA:0.09g(1mmol/L)10%SDS●固体SDS 10g,加入灭菌水70ml溶解，最后用灭菌水定容至100ml。
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
软骨蛋白提取步骤
软骨蛋白提取步骤软骨蛋白提取是一种常用的实验方法，用于从软骨中提取蛋白质。
软骨是一种坚韧的结缔组织，主要由软骨细胞和软骨基质组成。
软骨蛋白是软骨基质中的主要成分，具有重要的生物学功能。
本文将详细介绍软骨蛋白提取的步骤及相关实验注意事项。
实验材料准备在进行软骨蛋白提取实验之前，需要准备以下实验材料：1.软骨样本：可以使用动物软骨（如小鼠、大鼠等）或人类软骨（如关节软骨、鼻软骨等）作为实验样本。
软骨样本应新鲜，保存在-80摄氏度的冰箱中。
2.细胞裂解缓冲液：根据实验需要选择合适的细胞裂解缓冲液，常用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液（PBS）、甘氨酸盐缓冲液（Tris-HCl）等。
3.细胞裂解酶：根据实验需要选择适合的细胞裂解酶，常用的酶有蛋白酶、核酸酶等。
4.蛋白质抽提试剂盒：根据实验需要选择适合的蛋白质抽提试剂盒，常用的试剂盒有RIPA缓冲液、细胞裂解液等。
5.离心管、离心机：用于离心样本以分离蛋白质。
6.电泳试剂：进行蛋白质分析时需要准备电泳试剂，包括凝胶、缓冲液、染色剂等。
实验步骤软骨蛋白提取的步骤主要包括软骨样本的处理、细胞裂解、蛋白质抽提和蛋白质分析等。
下面将详细介绍每个步骤的操作方法。
1.软骨样本的处理–将冰冻的软骨样本取出，放置在冰盒中解冻。
–使用去离子水或PBS缓冲液清洗软骨样本，去除表面的杂质。
–将软骨样本切割成小块，使其容易裂解和抽提蛋白质。
2.细胞裂解–将切割好的软骨样本置于细胞裂解缓冲液中，加入适量的细胞裂解酶。
–使用超声波仪器或研钵和研针进行细胞裂解，直至软骨样本完全裂解。
–将裂解后的混合液放置在冰上，以保持低温。
3.蛋白质抽提–使用离心机将裂解后的混合液进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等固体颗粒。
–取出上清液，加入蛋白质抽提试剂盒中提供的试剂，按照试剂盒说明书进行蛋白质抽提。
–使用离心机将抽提后的蛋白质样品进行离心，以去除残留的固体颗粒。
4.蛋白质分析–取出蛋白质样品，使用比色法或Western blot等方法进行蛋白质浓度的测定。
小鼠中提collagen i蛋白方法-概述说明以及解释
小鼠中提collagen i蛋白方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述Collagen I是一种重要的结构蛋白，广泛存在于动物体内的各种组织中，包括皮肤、骨骼、肌肉和血管等。
它不仅在维持组织的结构完整性和稳定性方面起到关键作用，还参与许多生物过程，如细胞迁移、细胞黏附和组织修复等。
因此，对Collagen I的研究具有重要的理论和应用价值。
目前，提取和纯化Collagen I蛋白的方法有很多种，但由于其在细胞外基质中的高丰度和结构上的复杂性，这些方法往往具有一定的复杂性和挑战性。
本文将重点介绍一种利用小鼠作为研究模型，成功提取和纯化小鼠中的Collagen I蛋白的方法。
本文将首先介绍提取小鼠中Collagen I蛋白的方法。
这涉及到从小鼠组织中获取Collagen I蛋白的样品，并对其进行初步的处理和纯化。
接下来，我们将详细介绍分离和纯化Collagen I蛋白的步骤。
这些步骤将包括多级的色谱层析和电泳技术，以确保最终获得高纯度的Collagen I蛋白样品。
通过采用上述方法，我们成功地提取和纯化了小鼠中的Collagen I蛋白，并经过进一步的分析和鉴定证实了其纯度和结构的正确性。
这一研究成果将有助于我们更深入地了解Collagen I蛋白的功能和作用机制，为相关疾病的治疗和组织工程领域的应用提供重要的基础。
综上所述，本文将介绍一种成功提取和纯化小鼠中Collagen I蛋白的方法。
通过这一方法，我们将为进一步的研究和应用提供有力的支持，推动Collagen I蛋白领域的深入发展。
1.2文章结构1.2 文章结构本文主要包括引言、正文和结论三个部分。
引言部分将概述研究背景和意义，介绍小鼠中Collagen I蛋白的研究现状，并指出本文的研究目的。
正文部分将分为两个主要方法进行阐述。
首先，方法一将详细介绍如何从小鼠身体中提取Collagen I蛋白，包括所需试剂和操作步骤等内容。
其次，方法二将详细介绍如何对提取的Collagen I蛋白进行分离和纯化的过程，包括采用的分离技术和纯化方法等。
蛋白提取率
蛋白提取率蛋白提取率是指从某一种食物或样品中提取出蛋白质的量与样品总重量的比值。
蛋白质是人体必不可少的六大营养素之一，对于人体的健康具有重要的作用。
蛋白提取率的高低直接影响着某一种食物或样品中蛋白质的含量，因此提高蛋白提取率对食物行业至关重要。
首先，提高蛋白提取率需要选择合适的提取方法。
常用的蛋白提取方法有酸提、碱提、酶解等。
酸提法是指利用酸来打破蛋白质分子内部的化学键，并且使蛋白质分子从固体转化为溶液，是应用最广泛的提取法。
碱提法则是将样品溶于高碱度溶剂，使蛋白分子分离出来。
酶解法则是用特定的酶定向分解特定的蛋白质，可以提高蛋白质的纯度。
不同的提取方法会影响到蛋白提取的效率，因此需要选择合适的方法。
其次，提高蛋白提取率还需要优化操作条件。
包括样品的处理方法、提取剂的添加量、提取时间和提取温度等。
样品处理包括冷冻干燥、切片等方法，目的是为了缩小提取范围和加速蛋白提取。
提取剂的添加量和提取时间需要在一定范围内进行调整来达到最大的蛋白提取率，不同的提取剂和不同的时间都会影响到蛋白质的提取。
提取温度也是影响蛋白质提取率的重要因素，过高或过低的温度都会影响到蛋白提取率的效果。
最后，操作规范也是提高蛋白提取率的重要环节。
操作规范包括对样品的存放、配制提取液、制备试样、提取等环节进行优化。
同时，还要注意操作过程中的卫生和安全问题。
卫生干净的实验条件和正确使用实验耗材可以保护试样不受污染，并且保证提取的蛋白质的纯度和质量。
总之，提高蛋白提取率离不开熟练的操作技巧和选取合适的提取方法，适当的操作条件和规范化的操作是提高蛋白提取率的重要保证。
未来对于蛋白提取率的研究将会越来越重要，因为蛋白质是人体必不可少的营养素之一，相关的工业生产和应用也越来越广泛。
蛋白质的提取和分离实验操作
蛋白质的提取和分离实验操作蛋白质的提取和分离一样分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
(1)样品处理①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
采集的血样要及时分离红细胞，分离时采纳低速短时刻离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透亮的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时刻离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，说明红细胞已洗涤洁净。
洗涤次数、离心速度与离心时刻十分重要。
洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时刻过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的成效。
②血红蛋白的开释将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。
蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂开释出血红蛋白。
③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，能够明显看到试管中的液体分为4层。
第1层为无色透亮的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透亮液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。
将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透亮液体。
④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故交盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。
(2)凝胶色谱操作①凝胶色谱柱的制作②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。
运算所用凝胶量，并称量。
凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情形下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填平均。
色谱柱内不能有气泡存在，一旦发觉有气泡，必须重装。
装填完后，赶忙连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平稳凝胶12h，使凝胶装填紧密。
蛋白质样品制备技术
下来。许多潜在的杂质（如核酸）将保持在溶液中。
步骤：蛋白浓度大于lmg/ml，缓冲液浓度大于50mmol/L,并 含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和，搅拌10-30min，通过 离心沉淀蛋白。
然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的，因此，这种方法 只能被用来预分离或富集蛋白。并且，残存的硫酸铵会干 扰IEF,必须被清除。
磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。
4. 机械匀浆法
使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝
脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。
5.玻璃珠匀浆法
剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置
一、亚细胞器的分离
主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度 不同，在不同离心力场下进行差速离心或在不同密 度下进行密度梯度离心，从而获得不同亚细胞器组 分。
㈠ 细胞匀浆
取待分析的组织细胞样品以0.9 ％NaCl溶液反复 清洗，加入SE缓冲液（0.25mol/L蔗糖、1mmol/L EDTA)，在低温下研磨成匀浆备用。
白。
第一节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。
⑵ AEBSF
为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L ，作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低 。但
蛋白质制备及含量测定(凯氏定氮法)
实验六蛋白质制备及含量测定—微量凯氏（Mirco-Kjeldahl ）定氮法一、实验目的要求1、了解蛋白质提取的一般方法和原理2、了解蛋白质含量测定的常用方法3、学习微量凯氏定氮法的原理4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋白质含量的换算等。
二、实验原理1、蛋白质的提取与制备蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位有关。
如果是胞内蛋白，首先必须要进行细胞破碎。
细胞破碎的方法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。
如果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进行提取分离纯化。
如果待提取的蛋白质是具有生物活性的蛋白质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。
3、凯氏定氮生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。
凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。
其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。
这一步约需2〜3h,视样品的性质而定。
天然的含氮有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解,而有机氮则变成氨（无机氮）, 并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
此时程称之为“ 消化”。
但是,这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点, 并加入硫酸铜作为催化剂, 以促进反应的进行。
组织蛋白提取方法
（IF=1.6）
● Xin Yue, Baozhong Liu et al.
An i-type lysozyme from the Asiatic hard clam Meretrix
meretrix potentially functioning in host immunity Fish & Shellfish Immunology 2011 Volume 30, Issue 2, Pages 550-558 （IF=3.044）
产品 磷酸化蛋白富集试剂盒 膜蛋白提取试剂盒 BCA 蛋白定量试剂盒 蛋白 Marker 细菌膜蛋白提取试剂盒 植物总蛋白提取试剂盒 植物膜蛋白提取试剂盒 蛋白酶抑制剂混合物 磷酸酶抑制剂混合物 SDS-PAGE 上样 Buffer
产品号 BB-3108 BB-3103 BB-3401 BB-3721 BB-3151 BB-3124 BB-3152 BB-3301 BB-3311 BB-3703
肌肉、血管、结缔组织等哺乳动物组织中提取总蛋白。提取过程简单方便，可在 1 小时内完 成。该试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋 白提供了保证。本试剂盒含有的独特配方能够溶解细胞膜包括细胞质膜和核膜。提取的蛋白 可用于 Western Blotting、蛋白质电泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。
● Liu Tao, Chen Suhua et al.
In vitro study on human cytomegalovirus affecting early
pregnancy villous EVT's invasion function
Virology Journal
2011, 8:114
动物固体组织蛋白提取_Protocol
动物固体组织蛋白提取 Protocol1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。
早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。
2、 裂解液配制：RIPA ：PMSF=100：1，现配现用。
（1000ulRIPA+10ulPMSF ）。
置入4℃冰上。
3、抽蛋白（应冰上进行）：a 、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。
一般10ml 管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg 组织、1mlRIPA+10ulPMSF 、1 tablet Cocktail 。
b 、匀浆。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min 上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。
c 、将组织匀浆转入1.5ml 的EP 管中（eppendorf 管、离心管）。
12000r/min 4°C 离心15min 。
d 、离心后EP 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的EP 管中。
可-80℃保存。
4、蛋白浓度测定。
a 、配工作液：溶液A ：溶液B=50：1（200ul ：4ul ）。
大豆蛋白的提取、干燥、性质测定实验
大豆蛋白的提取、干燥、性质测定实验摘要：以大豆为原料，采用碱提酸沉法提取大豆蛋白，以蛋白质提取率为指标，通过查阅文献确定了提取大豆蛋白的最佳工艺：35摄氏度下，pH 10 ，浸提时间40 min, 液料比20：1( mL/g）。
将提取出来的大豆蛋白用真空冷冻干燥装置进行干燥，通过前后称重，计算大豆蛋白的提取率。
利用提取出来的大豆分离蛋白进行大豆蛋白的性质测定实验。
食品体系中的大豆蛋白所具有的功能性如下：功能性质作用方式食品体系溶解度蛋白质溶解性能，与pH等相关饮料类乳化性脂肪乳状液的形成以及稳定肉类、酱类、汤类持水性游离脂肪的吸附肉类、酱类起泡性形成稳定膜、固定气体搅打奶油、甜食粘度增稠作用汤类、肉汁凝胶蛋白质基质的形成凝乳、乳酪凝聚-粘附性蛋白质作为粘附剂香肠、焙烤制品粘弹性面筋中的疏水键，凝胶中的二硫键肉类、焙烤本组决定利用提取的大豆分离蛋白测定大豆蛋白的持水性。
关键词：大豆蛋白、碱提酸沉、真空冷冻干燥、持水性正文：实验材料仪器：天平、烧杯、量筒、玻璃棒、pH试纸、Sigma离心机、4℃冰箱、1号离心管、20ml离心管、50ml离心管、真空冷冻干燥箱材料：大豆粉、蒸馏水、氢氧化钠溶液、盐酸溶液实验步骤一、大豆蛋白的提取原理：大豆分离蛋白的生产方法常见的有: 超滤膜法、离子交换法、碱溶酸沉法, 其中碱溶酸沉法是我国普遍采用的生产工艺。
此法能够有效地提高产品得率,能充分利用蛋白资源。
生产的分离蛋白不仅除去了可溶性糖类, 还除去了不溶性聚糖, 因而蛋白质含量高。
该种工艺主要是基于调解溶液的 p H 值, 从而调解蛋白质的溶解度, 在 pH 值调至 4. 5 左右时, 由于蛋白质处于等电点状态而凝集沉淀下来, 经分离后得到蛋白沉淀物, 再经洗涤、中和、灭菌、干燥即得分离蛋白产品。
1、用电子天平称取大豆粉末10.01g，加入200ml蒸馏水，即液料比为20:1，搅匀.2、取40％的氢氧化钠10ml，加入100ml蒸馏水进行稀释，配制成稀碱溶液待用。
蛋白质分离纯化的步骤
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有：1.机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。
常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2.渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3.反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4.超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5.酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
（―）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。
此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
细胞和动物组织核蛋白的提取方法
细胞和动物组织核蛋白的提取方法产品组成 310001 310002规格 50 assays 100 assaysBuffer A (Cytoplasmic Extraction Reagent) 10ml 20mlBuffer B (Nuclear Extraction Reagent) 10ml 20ml蛋白酶抑制剂混合物 250ul 500ul使用方法：A．细胞蛋白提取1. 取5-10×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3. 每20ul细胞压积中加入200μl冷的Buffer A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10分钟。
4. 再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，16000×g条件下离心5分钟。
5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
6. 在沉淀中加入200μl冷的Buffer B，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒。
7. 置冰上40分钟，每隔10分钟高速涡旋振荡15秒。
8. 在4℃，16000×g条件下离心10分钟。
9. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。
B．组织蛋白提取1. 取适量组织样本剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
2. 在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，弃上清。
3. 按照细胞蛋白的提取方法的第3步骤往下操作即可。
上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用。
注意事项：1. 实验过程中的所有BestBio-贝博生物试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。
2. 整个过程须保持样品处于低温状态。
储存条件：-20℃保存。
有效期：一年。
全蛋白抽提试剂盒
凯基全蛋白提取试剂盒Cat Number：For Research Use OnlyStore at 4℃ for one yearExpire date：一、 试剂盒说明本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取全蛋白， 用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer匀浆裂解组织或细胞，作用温和，提取过程简便高效。
获得的全蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶免疫共沉淀的研究，因本试剂盒中包括这两种酶的抑制剂。
二、 试剂盒组份组份 KGP250 （50 tests） KGP2100（100 tests）储存温度 Lysis Buffer 50 mL 100 mL 4℃磷酸酶抑制剂 250 μL 500μL -20℃蛋白酶抑制剂 50 μL 100 μL -20℃PMSF（100mM）500 μL 1000 μL -20℃L三、 操作步骤Ⅰ 实体组织蛋白的提取1． 在每1mL 冷Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制剂， 1 μL蛋白酶抑制剂和 5μL 100mM PMSF，混匀。
冰上保存数分钟待用。
2． 每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5～1 mL冷 Lysis Buffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；3． 取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，离心10000转/分，4℃离心5 min；4． 取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford法、BCA法）；5． 分装保存于-70℃,避免反复冻融。
Ⅱ 培养细胞蛋白提取1． 贴壁培养的细胞，吸去培养基后，加入10mL/150mm培养板的冷PBS洗两次，每次振摇数次以尽量去除培养液；2． 悬浮培养的细胞或用细胞刮子刮下的贴壁细胞，将细胞及培养液移至离心管中， 1000转/分离心10 min，再用10mL/150mm培养板的冷PBS，1000转/分离心5 min洗两次；3． 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂， 1μL蛋白酶抑制剂和5μL 100mM PMSF，混匀。
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固体组织蛋白提取
2017-07-18
固体组织蛋白提取
1. 每100mg固体组织剪碎后加入0.5 ml裂解液，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次；或用高速机械匀浆器12,000 rpm 破碎组织。
注意：初始组织的量应在10-100mg范围。
肝肾组织蛋白含量高，提取时应加较少量的组织，否则形成的蛋白膜厚、致密且难溶。
2. 取0.5ml组织匀浆液转移到1.5ml离心管，加2倍体积的(1 ml)抽提试剂充分混匀。
室温或4℃静置10分钟，偶尔晃动。
注意：(1)组织量<10mg且静置时间短30min，在下一步离心时所形成的蛋白膜易碎，此时可静置30min。
(2)提取脂肪组织时应4℃静置40min以上以充分去除油脂。
3. 10,000g 4℃离心10分钟，溶液分为两相，中间为蛋白膜。
吸除上层液体；随后用吸头或针头轻轻拨开蛋白膜，吸除下层液体。
蛋白膜将附着于离心管壁。
注意：(1)离心速度过高将使蛋白膜过于坚固，难以溶解。
(2)如果初始组织量较少(<10mg)，离心后难以得到完整的蛋白膜，此时可吸去上下层液体，加入0.5-0.8ml纯乙醇混匀，10,000g 4℃离心5分钟。
弃所有液体，蛋白沉淀在管底。
4. 敞开管口，室温10分钟空气干燥沉淀。
5. 每100mg组织所得到的蛋白加 200ml用户自备的缓冲液，
95℃煮10分钟。
室温放置20分钟溶解沉淀。
注意：(1)可4℃过夜溶解沉淀，偶有少量不溶性组织纤维碎片可离心去除。
(2)有时染色体DNA可与蛋白质一起被抽提出来，溶解时则形成粘稠物。
延长95℃热变性时间、不时振荡、用注射针头反复抽吸，有助于彻底打断DNA。
3．样本组织RNA提取：取液氮保存的肺组织，研碎后加入RNAisoTMPlus，将研碎的样品完全覆盖，室温静置至样品完全融化，在研磨至裂解液呈透明状。
移至离心管后加入l／5l埘AisoTMPlus体积量的氯仿，用力振荡后移至离心管中，室温静置 5min。
12，000rpm／min 4 0C离心15min，取出离心管吸取上清夜，移入新的.离心管。
向上清中加等体积的异丙醇，混匀后室温静置
10min。
12，000rpm／min 4"C离心10min。
弃取上清，加入75％的乙醇lml，洗涤管壁后12，000 rpm／min4。
C离心5min，弃去乙醇。
室温干燥沉淀5min 后加入适量RNase．free水溶解沉淀，完全溶解后置于--80℃ 保存。
4．按照试剂盒说明在微管中配制反应混合溶液，将提取的RNA),II入微管后70℃ 反应5min，离心收集。
依试剂盒说明依次加入5×reaction buffer，Ribolock Ribonuclease inhibitor和10 mM Dntp mix，混匀后离心收集。
置
于25℃5min。
加入逆转录酶，然后置于25℃10min，再置于42℃60min，加热到70℃10m in停止反应。
组织剪碎，称重，加裂解液（含蛋白酶抑制剂）后匀浆，超声破碎也可以，注意要在冰上进行。
然后12000转，10分钟，4度，离心取上清，测蛋白浓度，加loading buffer煮沸5-10分钟，做western
天根有一款样本保存液，能迅速渗入组织细胞，高效抑制RNase活性。