实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量

实验一 双缩脲法测定血清蛋白质含量

【实验名称】：双缩脲法测定血清蛋白质含量

09救援一班 第三大组 李岚宇 2009222336

室温：20°

（一）实验目的： 1.掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。2.学习掌握分光光度计的使用。

3.掌握标准曲线的制作。

4.学习分光光度法测定的原理和方法。

（二）实验原理：血清中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H 2N-OC-NH-CO-NH 2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm 处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。

（三）实验材料与仪器：

1.仪器和材料： 分光光度计、7支试管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐标纸。

2.试剂：6mol/L 的NaOH 、双缩脲试剂、9g/L 的NaCl 溶液、蛋白质标准液（10g/L)、待测血清样本。

（四）实验步骤和结论:

1.取7支试管，编号，按照图1操作并记录。

表 1

2.在坐标纸上以各管蛋白质含量为横坐标，光吸收值（两管平均值）为纵坐标，绘制标准曲线。

表2 试剂 管号 空白管 标准管 测定管 1 2 3 4 5

蛋白质标准液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 - 待测血清样本 - - - - - - 1.0 氯化钠溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 - - 双锁脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 λ光吸收值 0 0.085 0.181 0.261 0.354 0.438 0.317 各管浓度 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1.4

3、由标准曲线查出待测的血清样本的蛋白质浓度，由表1得出测定管的蛋白质的λ光吸收值为0.317，由表2得出测定管的蛋白质的浓度为1.4g/L

4、按照光吸收法计算公式计算，从标准管中选一管与测定管光吸收值接近者，按公式

标

测标测A A C C 计算待测血清样本的蛋白质浓度，从上可选测A = 0.317

标C =0.354 ,标A =1.6 g/L ; 则得到：测C =1.432 g/L

【注意事项】 ： 1.本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须清洁，整齐、干燥。蛋白质标准液和血清取量必须准确。

2.各管加好样后必须充分混匀。显色反应需在20到30min 才完成。

3.3用分光光度计要注意：取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污；液体的体积为比色杯的2/3-3/4;不要将比色杯放在分光光度计上；试验完成后，关闭电源，洗净比色皿。

【思考题】1、蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物，这种紫红色络合物在540nm 处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。

3、各管加好样并充分混匀后，20到30min 才能完成显色反应，所以本实验在加入双缩脲试剂20到30min 左右的时间才进行比色，在显色后30min 内进行显色，且各管测定时间几乎要相同。