去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟草中的瞬时表达

去甲基化酶基因AtROS1化学诱导表达载体的构建及其在烟

草中的瞬时表达

常英英;梁立雄;高亚南;王颜波;丁昌俊;苏晓华;张冰玉

【摘要】植物去甲基化酶ROS1是表观遗传中一种重要的作用因子，参与基因的表达调控，与植物的生长发育及各种逆境响应过程密切相关。以拟南芥AtROS1基因为目的基因，采用“酶切—连接”的方法构建了以17-β-雌二醇为诱导剂的植物表达载体pER8-ROS1。将其转入农杆菌LBA4404菌株中，通过烟草瞬时表达技术，对该载体的诱导表达特性进行了研究。 qPCR结果表明：17-β-雌二醇处理能够有效调控pER8-ROS1中目的基因的表达，17-β-雌二醇最佳诱导浓度为50～100μmol· L－1；随着诱导时间的延长，目的基因表达量逐渐升高，在12 h 后达到最高。该诱导表达载体的构建为研究植物抗逆胁迫过程中的表观遗传机制奠定了基础。%Plant demethylase ROS1 was an important factor in epigenetic regulation .It could activate the expression of genes and was closely related to the processes of plant development and various stress responses .In this study , At-ROS1 gene from Arabidopsis thaliana was used as the target gene , and ‘digestion-ligation'method was applied for constructing plant expression vector pER 8-ROS1 which could be induced by 17-β-estradiol.Then the vector was transferred to Agrobacterium tumefaciens LBA4404 , and the inducible expression characteristics were verified by the transient expression system of Nicotiana tabacum.The results of qPCR showed that 17-β-estradiol could effectively induce the expression of the target gene in pER 8-ROS1 and the optimal concentration of 17-β-estradiol was 50 to 100μmol· L-1 .The expression

level of ROS1 gene gradually increased and reached the highest level at 12 h.The con-struction of pER8-ROS1 laid a good foundation for the epigenetic mechanism study in plant environmental stress .

【期刊名称】《浙江农业学报》

【年(卷),期】2016(028)005

【总页数】7页(P717-723)

【关键词】pER8-ROS1;17-β-雌二醇;化学诱导表达载体;瞬时表达

【作者】常英英;梁立雄;高亚南;王颜波;丁昌俊;苏晓华;张冰玉

【作者单位】中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091;中国林业科学研究院林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室，北京 100091

【正文语种】中文

【中图分类】Q943.2

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，是植物正常生长发育所必需的，也是植物逆境响应的重要机制。DNA甲基化的水平主要靠DNA甲基化和去甲基化的作

用调节，这2个过程相互平衡，维持了DNA甲基化模式的稳定。植物基因组甲基化模式的形成主要依赖于主动去甲基化，因此主动去甲基化的研究逐渐成为甲基化研究领域的重点之一。在植物中可能存在5种DNA主动去甲基化机制：DNA糖

基化酶参与的碱基切除修复机制(base excision repair，BER)、脱氨基作用及G/T 碱基错配修复机制、核酸切除修复机制、氧化去甲基化机制及水解去甲基化[1]。DNA去甲基化酶参与DNA主动去甲基化过程，并且占主导地位。植物中的去甲

基化转移酶主要有DME，ROS1，DML2和DML3 4个家族，它们均含有最保守

的DNA糖基化酶结构域[2-4]。其中，ROS1是植物体内第一个被克隆的去甲基化酶基因；植物通过ROS1家族介导的碱基切除修复(BER)机制实现DNA主动去甲

基化[3]。在BER途径中，ROS1双功能团酶切除甲基，使脱氧核糖和5-mC之间的核苷键断裂，产生DNA链上的AP(apurillic/apyrimidinic)位点，ZDP和

APE1L将3′磷酸变成3′羟基，最后，由DNA聚合酶和DNA连接酶填补此缺口，最终C取代5-mC[5-6]。ROS1是该通道中发挥作用的主要功能蛋白。拟南芥ROS1功能缺失突变体研究表明，ROS1能够使目的基因启动子发生去甲基化，激活沉默基因的表达，从而调控植物生长发育及对环境胁迫的应答[3，7-10]。另外，ROS1还可以阻止RNA介导的DNA甲基化[11-13]。因此，研究ROS1的生物学功能对于丰富DNA主动去甲基化的机制，了解植物生长发育的调控机制，以及采用分子育种手段定向培育抗逆性强的树木新品种都具有重要价值。

化学诱导表达系统是研究基因功能的有效手段之一[14]。其中，类固醇激活系统是基于糖皮质激素受体、雌激素受体等建立的较为精密的化学诱导表达系统，其主要是通过糖皮质激素受体、雌激素受体作为转录激活因子与融合启动子结合，来调控下游基因的表达。当类固醇存在时，受体从细胞质的热休克蛋白90(HSP90)中解