3愈创木酚法测定过氧化物酶活性

过氧化物酶活性的测定（比色法）

一、原理：过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，此产物在470 nm 处有最大光吸收值，故可通过测470 nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。

二、实验材料：植物叶片

三、设备与试剂：电子分析天平，分光光度计，低速冷冻多管离心机，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。

（1）100mmol/L 磷酸缓冲液（pH=6.0）：[0.2M的Na

2HPO

4

12.3mL和NaH

2

PO

4

87.7mL混合后稀

释2倍]

（2）反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保存于冰箱中。

四、操作步骤

1.称取植物材料1g，放入研钵中，适量液氮研磨成粉末，加适量的磷酸缓冲液于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心15分钟，上清液转入100ml容量瓶中，残渣再用5mL磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于冷处备用。

2.取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液1mL（或加热煮沸5 min 的酶液），作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上在波长470nm下测量吸光度值，每隔0.5min（30S）读数一次，连续读数3次。

五、结果计算：

以每分钟内A470变化0.01 为1 个过氧化物酶活性单位（U）

式中：△A470——反应时间内吸光度的变化；

W——植物鲜重（g）；

t——反应时间（min）；

V T——提取酶液总体积（mL）；

V S——测定时取用酶液体积（mL）。

六、注意事项

酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行。H2O2要在反应开始前加，不能直接加入。