抗体制备

100X HAT贮存液


H 13.6mg/ml
A 0.019mg/ml T 0.388mg/ml
100X HT 贮存液
H 13.6mg/ml
T 0.388mg/ml


8-杂氮嘌啉
8-杂氮嘌啉 200mg DW: 10ml 加1NNaOH 至溶解 加DW至 20ml 过滤除菌 分装-20 0C保存
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。

物理法是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其 原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主 要有PVP和CMC等； 化学法是利用某些功能基团把半抗原连接到白质 类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用 不同的方法进行连接。

根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法 主要有以下几类： ①带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原： 羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基 形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体 羧基缩合。 ②带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与 载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基 的半抗原衍生物后才能与载体连接。 ③带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮 化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原 衍生物。
3. 动物采血 采集免疫血清前，要预先测试抗体效价 测定，若效价达到要求，应在末次免疫后 一周及时采血，否则抗体效价会下降。 (1) 颈动脉采血法 (2)心脏采血法 (3)静脉采血法
图1 颈动脉分离图
三、免疫血清的纯化
1. 特异性抗体的纯化 免疫原不纯，导致产生杂抗体混杂于抗 血清中。杂抗体的除去可采用：。 (1) 亲和层析法 （2）吸附法


弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）,分为弗氏 不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化 剂（羊毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例 混合而成； 后者由弗氏不完全佐剂加卡介苗组成。在 免疫动物时，先将弗氏佐剂与抗原等比混 匀，制成“油包水”乳化液。

佐剂与抗原混合乳化的方法： 研磨法 和搅拌混合法两种
第二节 单克隆抗体的制备
Preparation of monoclone antibody

克隆(clone)
是指无性繁殖 细胞系，是由单一个祖先 细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。 在这个家族的所有成员中，如无突变发 生，其基因是完全相同的。
单克隆抗体（McAb）
是由只识别单一抗原决定簇的B细胞克 隆产生的同源抗体。
一、杂交瘤技术的基本原理
一、杂交瘤技术的原理及流程
二、单克隆抗体制备技术
1. 主要材料
2. 细胞融合前准备
3. 细胞融合
4. 抗体的初筛和克隆化
5. 杂交瘤细胞冻存与复苏
6. 单克隆抗体的批量生产
7. 单克隆抗体的纯化与鉴定
（一）主要材料：

RPMI1640培养液 FCS 10% 谷氨酰胺 2mmol/L 青霉素 100IU/ml 链霉素 100Ug/ml
↓3周后 第三次免疫 剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合
2. IgG类抗体的纯化 IgG类抗体的纯化常用方法有盐析法、凝 胶过滤、离子交换层析、亲和层析等方法。 (1) 盐析法：硫酸铵盐析常用于γ-球蛋白提取， 经三次沉淀后提取的γ-球蛋白大多属于IgG。
(2) 凝胶过滤法：各种蛋白质成分的分子量大 小不同，在通过凝胶介质时，洗脱速度也 不同，从而达到分离目的。 血清蛋白的分级分离常用凝胶过滤法 进行，按分子大小可分为三组：第一组包 括IgM和一些脂蛋白；第二组主要是IgG和 较少量的IgA、IgD、IgE等球蛋白；第三 组主要白蛋白、血清粘蛋白、铁传递蛋白 等（见图2）。
3.纯化抗原的鉴定
抗原鉴定：含量、分子量、纯度及免疫学活性等。



蛋白含量的测定可采用双缩尿法、酚试剂法、紫外 光吸收法等； 分子量鉴定可用SDS-PAGE法、凝胶过滤法等； 蛋白质纯度鉴定方法常用的有：醋酸纤维膜电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、毛细管电泳、 等电聚焦、高效液相层析法等。 免疫学活性鉴定常用免疫双向扩散法、免疫电泳法 或ELISA法等。
图3 在DEAE-纤维素上人血清蛋白的层析示意图 (M=IgM, G=IgG, A=IgA)
(4) 亲和层析法纯化
葡萄球菌A蛋白（SPA）或连球菌G蛋白具有与 IgG Fc段结合的能力，可用亲和层析来分离IgG。 分离时可采用两种类型的亲和层析柱即SPA或G蛋 白交联至Sepharose 4B制成的亲和层析柱。抗血清通 过层析柱时，IgG被吸附，而非特异性蛋白则未能结 合被洗脱除去，然后改变洗脱条件，使IgG从层析上 解离从而达到纯化目的 。
第十一章 抗体制备



抗体的制备技术经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免 疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中 某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为 基因工程抗体(genetic engineering antibody)。本 章主要介绍三种类型抗体的制备方法。
图2 在凝胶过滤柱上血清蛋白的层析示意图 (M=IgM, G=IgG, A=IgA)
(3) 离子交换层析法纯化IgG


IgG作为一种γ-球蛋白，在血清蛋白中带电荷较最 少，用离子交换层析法易于分离。DEAESephadex A-50是一弱碱性离子交换剂，常用于免 疫球蛋白的纯化。 血清中的γ-球蛋白属于中性蛋白，其余均属酸性 蛋白。在pH7.2～7.4的环境中, 酸性蛋白被DEAESephadex A-50吸附，γ-球蛋白不被吸附而得以纯 化。该技术纯化IgG简便，不损坏抗体结构和特 异性。
其理化性状高度均一、效价高、只与一种抗原表 位发生反应、生物活性单一，具有高度特异性又 易于大量制备
单克隆抗体制备方法：

杂交瘤技术

EBV技术
杂交瘤单克隆抗体??

通过抗原致敏B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合
形成杂交瘤细胞，经克隆化培养所形成单克 隆杂交瘤细胞克隆，所分泌的针对抗原上某 一抗原表位的纯的抗体，具有生物活性单一， 理化性质高度均一，产量高等特点。
五、免疫血清的保存
①4℃保存：存放于4℃冰箱，一般可可保存半年，效 价高时可保存一年，但抗体活性有些降低。 ②低温保存：是常用的抗体保存方法，将抗体分为小 包装于-20～-70℃保存，一般可保存5年抗体效价无 明显下降，但要避免反复冻融。 ③真空干燥保存：用冷冻真空干燥器进行干燥，制成 干粉，封装后可在普通冰箱中保存5～10年抗体效 价无明显变化。
（2）化学法：化学法主要有酶处理法、表面 活性剂处理法等方法。

2.可溶性抗原的提取与纯化
（1）超速离心分离法 （2）选择性沉淀法 ①盐析法： ②有机溶剂沉淀法：。 ③高分子聚合物沉淀法：。 ④等电点沉淀法：。 （3）超滤法：
（4）层析法 ①凝胶过滤法 ②离子交换层析法 ③亲和层析法 （5）电泳法

二、免疫动物

为获取高质量的抗体，除了需制备高纯度 的抗原外，还需选择适宜的动物和设计有 效可行的免疫方案，如抗原的剂量、剂型、 注射途径、注射次数、注射间隔和接种动 物的年龄均与免疫效果密切的关系。
1.免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物 种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而 同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常 动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、 豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、 山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类。
聚乙二醇
PEG: 30~50 %
Fra Baidu bibliotek


P=m/(m+v)×100%
（二）细胞融合前准备
1. 免疫方案
颗粒性抗原 可溶性抗原
2. 饲养细胞
3. 骨髓瘤细胞
4. 免疫脾细胞
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射 (一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫
剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip (ip剂量不宜超过0.5ml)
一、免疫原制备

免疫原(immunogen）是指能刺激机体免疫 系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗 原。
（一）细胞性抗原的制备
1.绵羊红细胞的制备 2. 细菌抗原的制备
（二）可溶性抗原的制备 1. 细胞破碎 （1）物理法：物理破碎法主要有高速组织捣 碎机处理法、玻璃匀浆器处理法、超声破碎 法、反复冻融法等方法。
载体
载体
SPA IgG 杂质 再生 洗脱
图4 亲和层析纯化IgG基本过程示意图

四、免疫血清的鉴定
1. 效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗 原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。 2. 特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、 免疫电泳法。
3. 纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺 凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳 等方法。IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE 结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD）， 若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需 进一步纯化。 4. 亲和力的鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透 析法、ELISA或RIA竞争结合试验等。
2. 佐剂的免疫生物学作用
①增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的 物质变成持久或强的免疫原； ②增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应 答和再次应答所产生的抗体滴度； ③改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变 为IgG型； ④引起或增强迟发性超敏反应。
3. 佐剂的作用机制
佐剂的作用机制归纳起来主要有如下几种：
2.免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、 免疫途径、免疫次数、免疫间隔等因素。 (1) 免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原 性的强弱、动物的个体状态和免疫时间来确定。 首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻 痹。
(2) 免疫途径与免疫间隔时间


免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹 腔、淋巴结等，视不同的免疫方案而异。对于不易 获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。 免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素，其 中首次与第二次免疫的间隔时间尤为重要，一般以 10～20天为佳，二次后间隔时间一般为7～10天， 若间隔时间太长，则刺激减弱，抗体效价不高。
（五）免疫佐剂

某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体， 可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或 改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐 剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。
1.
佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类： ①无机佐剂，如氢氧化铝、明钒等； ②生物性佐剂，如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆 菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素 的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等； ③人工合成佐剂，如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I： C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）； ④油剂，如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等； ⑤纳米佐剂。

（三）半抗原性免疫原的制备
1.载体选择 常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。 （1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋 白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。 （2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也 是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲 基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完 全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。

①可增强抗原的表面积和改变抗原活性基团构型， 从而增强抗原的免疫原性；

②佐剂与抗原混合一起注入机体，可改变抗原的物 理性状，形成抗原储存库，延长抗原在局部组织的 滞留时间，有利于抗原的缓慢释放； ③增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易 被吞噬细胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴 细胞增生，从而增强和扩大免疫应答的效应。