生物膜微生物活性的测定

生物膜微生物活性的测定(TTC-DHA)法

在本课题研究中，生物膜微生物的活性通过氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶活性测定法进行。利用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride ，TTC；Shanghai Reagent Co., Ltd, Shanghai, China)的还原性产物TTC-甲瓒(TF)的量，来表示微生物的活性。

一、生物膜样品的制备

取10g载体生物膜，用蒸馏水润洗2次，置于锥形瓶中，用玻璃珠剧烈摇动将生物膜打碎，用生理盐水20mL稀释，用玻棒搅动，使成悬液，备用。

二、主要仪器和试剂

氯化三苯基四氮唑( TTC)-葡萄糖标准溶液:TTC分析纯0.1 g与葡萄糖l g共溶于100 mL蒸馏水中，棕色试剂瓶保存；甲苯(分析纯)；三氯甲烷(分析纯)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCI缓冲溶液，pH值为8．6；其它：硫化钠。

三、标准曲线的制作

在分液漏斗中依次注入l，2，3，4，5，6 mL浓度为l g ·L-1 TTC-葡萄糖标准溶液，2 mL Tris-HCI缓冲溶液及lmL 10％Na2S新配溶液,摇匀；待溶液充分显色后，准确加入甲苯溶液5mL，振摇，完全提取TF。放置片刻；待溶液分层后，取有机溶液层, 移至lcm比色皿中,稳定2 min用752紫外分光光度计在波长485nm处，测对应的吸光度

(A)值，对脱氢酶活性作图，以试剂空白作对照，绘制标准曲线。

四、生物膜脱氢酶活性测定

取生物膜制备液2mL于带塞试管中，依次加入Tris-HCl缓冲液、0.1 mol ·L-1葡萄糖液、0.5％TTC各2 mL，置入37±1℃恒温箱中培养6 h后取出，加2滴浓硫酸终止反应，准确加入5 mL甲苯，振摇，在4000 rpm下离心5 min，取有机溶剂层比色。在上述条件下，将1h产生1µgTF的量为1个酶活力单位。