药品微生物限度检验方法标准操作规程.(DOC)

标准操作规程

目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。

范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。

责任者：QC主任、化验员。

规程：

本规程引至《中国药典》2000年版。

1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。

2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。

3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。

4. 检查：

4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。

4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。

4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。

4.4. 复检

4.4.1. 菌数测定不合格者应复检，控制菌检查以一次检出为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。

4.4.2. 以复试项下不合格项目为准，作单项复试。复试需另取同批号样品，测定2次。

4.4.3. 复试报告，以3次测定结果的算术平均值报告。

4.5. 检验报告

4.5.1. 检验报告以1g、1ml或10cm2为单位。

4.5.2. 测定菌数报告，以每次测定结果全部平均值报告。

4.5.3. 控制菌按检验结果报告，如未检出控制菌时，报告为“按规定抽样检验结果未检出XX菌”，如抽样中任意一样品要检出控制菌时，报告为“按规定抽样，检出XX菌，不符合药品微生物限度标准。”

4.6. 培养基、试药及稀释剂的相关内容见本文件附录三。

4.7. 供试液的制备：按供试液的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。

4.7.1. 供试品的取样及注意事项

供试品取样应有一定数量，以使检验结果具有代表性，正常的供试品一般每批应随机抽取两瓶或两盒以上的包装单位，检验时每次应分取两瓶(盒)以上的样品共10g或10ml。

供试品在检验前，应严格保持包装的原有状态，不得启开，并放在阴凉干燥处，防止微生物再繁殖，以免影响检验结果，凡已将原包装启开，则无代表性应另取样。

供试品稀释后须在1－2小时内操作完毕，防止微生物繁殖或死亡。

供试品稀释成供试液后，应在均匀状态下取样，凡因抑菌或不溶于水的剂型，其供试品应作特殊处理后进行检验。

4.7.2. 液体供试品：取供试品10ml，加入稀释剂90ml中，混匀，作为供试液。油剂可加适量聚山梨酯80，混匀，吸取相当于10g或10ml供试品，

再稀释成100ml作为供试液；合剂（系指含王桨或蜂蜜者，下同）可用供试品作为供试液。

4.7.3. 固体、半固体或黏稠液供试品：称取供试品10g，置0.9%无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜的方法混匀后作为供试液。在制备过程中，必要时可加适量聚山梨酯80，并适当加温，但不应超过45℃。

（1）非水溶性供试品：取供试品5g（5ml）加入含溶化的无菌司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃左右的0.9%无菌氯化钠溶液约80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液（1︰20）。

（2）肠溶胶囊（片）供试品：称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）100ml的锥形瓶内，于45℃水浴中，保温、振摇，使溶解，作为供试液。

（3）含抑菌成分的供试品照《中国药典》2000年版附录“微生物限度检测法”制备供试液。

4.8. 对照用菌液

4.8.1. 控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，大肠杆菌的对照菌株为[CMCC(B)44 102]，其余对照菌株见《中国药典》2000年版附录。

取相应菌株的营养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18－20小时后，稀释至1︰106。对照菌的加入量为50－100个。

4.8.2. 菌种短期保存法：凡使用菌种，一般接种在普通琼脂斜面上，经37℃培养18－20小时，取出在5℃的冰箱内保存备用即可，每月接种传代一次，数周内不致死亡。

4.9. 检查法

4.9.1. 检查前的准备：

A. 用具的洗涤与灭菌。

试管：使用过的试管经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用纯化水冲洗4－5次，倒立，晾干备用。灭菌前，用棉塞塞上管口，牛皮纸包紧，扎紧。

B. 吸管：使用过的吸管用清洁液浸泡数分钟后，用纯化水冲洗4—5次，晾干，备用。灭菌前，在吸管上端距0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，用牛皮纸裹紧。

C. 研钵：使用过的研钵用清洁液洗刷后，用纯化水冲洗数次，晾干备用。灭菌前，用牛皮纸将钵体和锤包裹。

D. 培养皿：使用过的培养皿经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗涮，用水冲洗4－5次，倒立、晾干各用。灭菌前，根据消毒器内经大小用牛皮纸包数个培养皿，扎紧。

将上述包好的用具，放在121℃的高压蒸汽消毒器中，灭菌30min后，放入微生物限度检查室定点位置，备用。

将所有已灭菌的培养皿、三角瓶、吸管（1ml、l0ml）、稀释剂及供试品等移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中人出操作间。将全开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使其工作30min。操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，再用0.1%新洁尔灭或用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口周围，待干后将供试品瓶、盒、袋启封，启封后先检查瓶盖内侧及瓶口周围有无生霉、长螨的迹象，对肉眼可见疑似者，若经证实为生霉、长螨即可判定为不合格，无须继续检验。

4.9.2. 细菌、霉菌、酵母菌计数。

4.9.2.1. 检查程序（如下列图1）。

4.9.2.2. 操作步骤

a. 供试液制备：经阴性对照联样后，按各类制剂备供试液的方法（见10供试液的制备）制备。

b. 稀释及取样

稀释：取1ml吸管1支，吸取混匀的1︰10供试液（或原液，1：20供试液）1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，测管壁注入装有9ml的稀释剂的试管中，混匀成1︰100（或1︰10，1︰200）的稀释液。

吸样：用上述吸管分别取1︰10供试液（或原液，1︰20供试液）1ml，注入2~3个平皿中，以另一支1ml吸管，按上述操作下一级的稀释与吸取。

c. 注皿与干燥