实验：血清成分分析--

血清成分分析

摘要：血清中含有有各种血浆蛋白（α、β、γ-球蛋白、清蛋白）、多肽、胆固醇、谷丙转氨酶、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。实验通过邻苯二甲醛法测定血清胆固醇的含量；通过盐析、透析与浓缩等方法分离血清中的清蛋白和γ-球蛋白并用醋酸纤维素薄膜电泳进行鉴定；通过纸层析法鉴定谷丙转氨酶活性。同时我们又探究比较家鸡和乌鸡血清中的胆固醇含量、谷丙转氨酶活力。

关键词：血清、家鸡、乌鸡、胆固醇、清蛋白、γ-球蛋白、谷丙转氨酶

Serum component analysis

College of life and Environmental Sciences， Class of 11 biological science

Zhang Fengping

Abstract:Serum contains a variety of plasma protein (α, β, γ - globulin, albumin), polypeptide, cholesterol, alanine aminotransferase, carbohydrate, growth factors, hormones, other inorganic compounds.Experiment through the adjacent benzene two formaldehyde method in determination of serum cholesterol content; by salting, dialysis and concentration method for the separation of serum albumin and gamma globulin and using cellulose acetate membrane electrophoresis were identified by paper chromatography; identification of alanine aminotransferase activity.At the same time we also explore the comparison of chickens and chicken serum cholesterol content, alanine aminotransferase activity.

Keyword：Serum, chick, chicken, cholesterol, albumin, γ - globulin, alanine transaminase

1.前言：

血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。血清清蛋白与γ-球蛋白是血清的重要成分，通过实验掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法；掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法；掌握凝胶过滤层析的技术方法；掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。谷丙转氨酶是肝功能检查项目中一项比较灵敏的指标，实验用纸层折法观察肝脏谷丙转氨酶（ALT）的转氨基作用；用分光光度法测定血清谷丙转氨酶的活力。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。血清胆固醇是测定血脂的常规项目，试验用邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇，来比较家鸡与乌鸡血清的区别。

2.实验内容与结果

实验一血清胆固醇的定量测定

（1）实验仪器及试剂：50ml和100ml容量瓶，烧杯，电子分析天平，分光光度计，邻苯二甲醛试剂，90%醋酸，标准胆固醇应用液（0.1mg/mL），混合酸，标准胆固醇贮液（1mg/mL）（2）实验步骤：

a、标准曲线的绘制

取清洁干燥试管5支，编号，按表2加入试剂。

表2 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线的绘制

加毕，混匀，静置10min，以550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。

b、样品的测定

取3支清洁干燥试管，编号后，按表3加入试剂。

表3 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——样品的测定

*硫酸含量的高低对显色有影响，故混合酸的配制和测定过程中的加量都应准确。

显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会升得太高，一般在4~32℃时，颜色能稳定2h。

加毕，混匀，静置10min，于550nm波长比色，以对照管校零点，对照标准曲线即知100mL 样品中总胆固醇含量（mg）。

（3）实验结果：

故由标准曲线得，家鸡血清中胆固醇含量为36mg，

乌鸡血清中胆固醇含量为31mg

实验二血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定

（1）实验仪器及试剂：离心机，烧杯，移液枪，透析袋，PBS，（NH4）2SO4溶液，双缩脲试剂，酪蛋白，蔗糖，BaCl2溶液

（2）实验步骤：

（二）蛋白质透析与浓缩的实验步骤

a.取玻璃纸（15cm×15cm）两张，折成袋状。将前面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和γ-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。

b.用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，流水透析1h。

c.将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩。

（三）醋酸纤维素薄膜电泳的实验步骤

（3）实验结果：

凝胶层析结果

醋酸纤维素薄膜电泳结果

实验三谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定

（1）实验仪器及试剂：圆形层析滤纸，水浴锅，研钵，脱脂棉，双层纱布，培养皿，烘箱，分光光度计，移液枪，0.9% NaCl溶液，海砂，1% 谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和），1% 丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和），0.1% KHCO3溶液，0.025% 溴乙酸溶液（用1%KOH中和），2% 乙酸溶液，苯酚的饱和水溶液，0.1% 水合茚三酮的正丁醇溶液，0.1% 标准谷氨酸溶液，0.1% 标准丙氨酸溶液，1% KOH溶液，1/15 mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液，GPT基质液（谷丙转氨酶底物），1mmol/L 2，4-二硝基苯肼，0.4mol/LNaOH溶液，家鸡和乌鸡的肝脏

（2）实验步骤：

（一）谷丙转氨酶提取液制备

（二）转氨作用