PCR反应体系有关的过程

PCR反应体系有关的过程

姓名：于烨敏学号：11243220 班级：113

第一部分

1、 PCR原料：

DNA模板:

模板包含要用来扩增的靶基因区域，适当提高模板浓度，可减少循环次数，从而减少突变的发生和非特异性产物的形成；但过高的模板浓度会降低反应效率。

上游引物和下游引物：

是人工合成的短的单链DNA片段（寡核苷酸），经常由18-30个碱基组成，用来确定扩增区域的起止位点从而确定扩增的DNA片段大小；物与要扩增的双链DNA的两端精确互补，在退火中可以与DNA模板链特异性地结合。当引物与模板链结合后，DNA聚合酶就开始从引物链的结合位点催化合成新的DNA链。引物的量不能太多，过多的引物导致非特异性扩增的发生和引物二聚体的形成。

聚合酶：

聚合酶从引物结合位点开始沿DNA链移动，阅读DNA编码信息，填充正确的匹配核苷酸，催化DNA新链的合成；来源于生活在热泉中的一种细菌Thermus aquaticus的Taq聚合酶是目前使用最广泛的聚合酶。由于Taq酶没有3'-5'外切酶活性，在复制DNA的过程中可能会随机的引入错误的碱基。对于一般的PCR实验来讲，错误的产生不影响实验的结果；但特定的实验，如扩增的序列是用在测序或蛋白表达等用途时最好使用有较读活性的高保真酶，如Tli或Pfu。由于Taq酶相比其它酶要求的反应条件简单，扩增效率较高，因此可同其它酶混合起来以提高扩增长片段时的保真性。单独使用高保真酶扩增的产物如果与具有黏性末端的载体相连前，通常利用Taq酶在产物的3'末端增加一个多余的A碱基。

四种dNTP（dATP，dCTP，dGTP和dTTP）：

是合成DNA新链的原料。dNTP的量与合成产物的大小有关，越长的片段需要越多的dNTP，但过多的dNTP能增加复制的错误率并可能抑制Taq酶活性。

缓冲液：

为维持DNA聚合酶的活性提供必要的pH值和离子浓度。

Mg离子：

Mg离子对于维持聚合酶的活性是必须的，它通过稳定引物－模板相互作用而影响退火进程；同时也能稳定聚合酶同引物－模板形成的复制复合物，因此可以增加非特异性退火，进而形成非特异性产物。许多成分如EDTA和dNTP可以结合一部分Mg离子，所以Mg离子准确的用量需要实验来确定。一般来讲，低浓度的Mg离子增加复制的可信度，而高量的Mg离子降低特异性、引入突变。一般反应可通过变化温度、模板质和量而规避提高Mg量的操作。

添加剂：

1. 7-deaza-dGTP, Glycerol (5-10%), formamide (1-5%) or DMSO (2-10%)：当模板GC

含量高时，加入7-deaza-dGTP或DMSO可以降低互补碱基间的氢键从而降低反应需要的有效退火温度和变性温度。这些添加剂也会改变聚合酶的耐热性，Glycerol可保护聚合酶，防止热失活；而formamide可降低酶的耐热性。

2. 0.5-2M Betaine：当模板GC含量高时或扩增长片段时，加入后可降低变性温度到92-93℃，并使退火温度下降2-3℃，Betaine经常跟5％的DMSO一起使用。

3. TMAC (tetramethylammonium chloride), TEAC (tetraethylammonium chloride), and TMANO (trimethlamine N-oxide)；

4. BSA：可以提高PCR反应效率。

5. Triton X-100：可防止聚合酶的相互缔合或者黏附在反应管壁上

2、图形原理：

3、DNA 聚合酶说明书：

第二部分

一选取目的基因的具体来源

Escherichia coli plasmid pNGX2-QnrS1, complete sequence

NCBI Reference Sequence: NC_019047.1

FASTA Graphics

LOCUS NC_019047 423 bp DNA linear CON 09-JUN-2013 DEFINITION（定义）Escherichia coli plasmid pNGX2-QnrS1, complete sequence.

ACCESSION NC_019047 REGION: complement(7133..7555)

VERSION NC_019047.1 GI:410488804

DBLINK Project: 178640

BioProject: PRJNA178640

KEYWORDS RefSeq.

SOURCE Escherichia coli

ORGANISM Escherichia coli

Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales;

Enterobacteriaceae; Escherichia.

REFERENCE 1 (bases 1 to 423)

AUTHORS Johnson,T.J., Bielak,E.M., Fortini,D., Hansen,L.H., Hasman,H., Debroy,C., Nolan,L.K. and Carattoli,A.

TITLE Expansion of the IncX plasmid family for improved identification and typing of novel plasmids in drug-resistant Enterobacteriaceae

（改进的识别和耐药肠杆菌科新型质粒分型的相应质粒家庭的扩张）JOURNAL Plasmid 68 (1), 43-50 (2012)

PUBMED 22470007

REFERENCE 2 (bases 1 to 423)

CONSRTM NCBI Genome Project

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (01-NOV-2012) National Center for Biotechnology Information, NIH, Bethesda, MD 20894, USA

REFERENCE 3 (bases 1 to 423)

AUTHORS Johnson,T.J., Bielak,E.M., Fortini,D., Hansen,L., Hasman,H., Debroy,C., Nolan,L.K. and Carattoli,A.

TITLE Direct Submission

JOURNAL Submitted (09-DEC-2011) Department of Infectious, Parasitic and Immuno-Mediated Diseases, Istituto Superiore di Sanita', Rome,

Italy