病毒抗原与抗体检测技术
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短寿命荧光完全衰变后再 测定镧系元素特异荧光 铕Ed3+ 锝Tb3+ 钐Sm3+ 镝Dy3+
四、时间分辩免疫荧光技术
（二）方法类型 双抗体夹心法
固相抗体和Eu3+标 记抗体与待检抗原 结合，形成固相抗 体-待检抗原-Eu3+ 标记抗体复合物， 酸性增强液下， Eu3+解离，340nm 激发光下发射 613nm荧光。
三、免疫荧光显微镜技术
透射光：照明光线从标本下经聚光器透 落射光：照明光线从标本上经垂直照明
过标本进入物镜。
器落射到标本，经标本反射进入物镜。
四、时间分辩免疫荧光技术
Time-resolved fluoroimmunoassay TR-FIA
（一）原理
自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs
四、时间分辩免疫荧光技术
（二）方法类型 固相抗体竞争法
待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗 涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度 与待检抗原含量成反比。
固相抗原竞争法
待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体， 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧 光强度与待检抗原含量成反比。
二、免疫荧光试验
（一）原理
用荧光标记物标记病毒抗原或抗体，作为分 子探针，检查细胞或组织内相应的病毒抗体 或抗原。荧光标记物受激发光照射后发光， 用荧光显微镜观察，可确定病毒种类、定位、 定量。
二、免疫荧光试验
（二）类型 荧光抗体法 荧光抗原法 免疫细胞（组织）化学技术
二、免疫荧光试验
四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC)
藻红蛋白（PE）
550nm 490-560nm
620nm（橙红色） 595nm（红色）
FITC的衬比染色或双标 记FAT
双标记FAT、流式细胞术
7-氨基-4-甲基香豆素 354nm
Eu3+螯合物
340nm
430nm（蓝色） 613nm
双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
第二节 酶免疫技术
Enzyme immunoassay
抗原抗体反应特异性 酶高效催化反应专一性
第二节 酶免疫技术
酶
辣根过氧化物酶 HRP
底物
邻苯二胺OPD 四甲替联苯胺TMB 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐
显色反应
橘红色 黄色 棕色 兰色
蓝绿色
测定波长
一、抗原—抗体反应
特异性高 可逆
氢键、范德华力、静电吸引力
可见
抗原-抗体比例适宜，复合物相成团
二、影响反应的因素
电解质
pH≥7时，适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀
温度 37℃
温度升高，反应加快 <56℃
酸碱度 pH6~8
接近等电点时易出现假阳性
第一节 免疫荧光技术
Immunofluorescence assay IFA 能解决：是什么 在哪里 有多少
荧光 激发光谱 发射光谱 荧光效率 荧光寿命 荧光猝灭 荧光偏振
第一节 免疫荧光技术
荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
最大发射光谱
应用
异硫氰酸荧光素 (FITC)
490～495nm 520～530nm （黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定
四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 记FAT
二、免疫荧光试验
3.鉴定制成的荧光抗体 以FITC为例
荧光（F）蛋白（P）结合率
调整制备液至A280mm=1
F/P=
2.87×A495mm A280mm-0.35×A495mm
比值越大，抗体结合荧光素越多
二、免疫荧光试验
3.鉴定制成的荧光抗体 测定抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体特异性染色滴度：倍比稀释
二、酶联免疫吸附试验
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
Leabharlann Baidu
三、免疫荧光显微镜技术
荧光显微镜
利用一定波长的激 发光对样品进行激 发，产生一定波长 的荧光，对样品结 构或其组分进行定 性、定位、定量观 察检测。
三、免疫荧光显微镜技术
光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 光路：透射光、落射光 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 镜头：消色差镜头
二、免疫荧光试验
4.荧光抗体染色 直接法
二、免疫荧光试验
4.荧光抗体染色 间接法
二、免疫荧光试验
4.荧光抗体染色 补体法 荧光标记抗补体抗体 双标记法 两种荧光素抗体检测两种抗原
二、免疫荧光试验
5.设立对照 区分特异性和非特异性染色 标本自发荧光对照 荧光抗体对照 阳性抗原对照 阻断试验
405 420
360,450 420
第二节 酶免疫技术
酶标记
戊二醛交联法
酶
蛋白质
醛基
过碘酸氧化法
过碘酸盐 HRP
HRP 醛基
第二节 酶免疫技术
固相载体 塑料制品 微粒 膜载体 NC膜、尼龙膜
第二节 酶免疫技术
包被与封闭 包被 适宜浓度蛋白质 封闭 二次包被填补空隙
小牛血清
492 460 449 425 642
碱性磷酸酯酶 AP 葡萄糖氧化酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
β-Ｄ－半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
黄色 红色
黄色 深蓝色
荧光 黄色
400 500
↓
↓
脱水脱色
冰冻切片
↓
↓
石蜡固定、脱蜡 丙酮固定、干燥
↓ 印片
二、免疫荧光试验
2.荧光抗体制备 制备抗体 用高纯度病毒免疫动物获取血清，分离IgG， 提纯
家兔、绵羊、山羊
高特异性
高亲和力
二、免疫荧光试验
2.荧光抗体制备 标记荧光素 共价键结合 抗体+荧光素
↓4℃持续搅拌数小时 纯化（离心、透析、过滤）
（三）方法 制备标本 制备荧光抗体 荧光抗体染色 荧光显微镜检查
二、免疫荧光试验
1.制作病毒染色标本 培养敏感细胞（细胞爬片）
↓ 种毒 ↓ 固定、干燥 丙酮
二、免疫荧光试验
1.制作病毒染色标本 临床样本（非固型组织） ↓ 涂片 ↓
固定、干燥
二、免疫荧光试验
1.制作病毒染色标本
尸检样品（3~5mm）
四、时间分辩免疫荧光技术
（二）方法类型 双抗体夹心法
固相抗体和Eu3+标 记抗体与待检抗原 结合，形成固相抗 体-待检抗原-Eu3+ 标记抗体复合物， 酸性增强液下， Eu3+解离，340nm 激发光下发射 613nm荧光。
三、免疫荧光显微镜技术
透射光：照明光线从标本下经聚光器透 落射光：照明光线从标本上经垂直照明
过标本进入物镜。
器落射到标本，经标本反射进入物镜。
四、时间分辩免疫荧光技术
Time-resolved fluoroimmunoassay TR-FIA
（一）原理
自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs
四、时间分辩免疫荧光技术
（二）方法类型 固相抗体竞争法
待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗 涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度 与待检抗原含量成反比。
固相抗原竞争法
待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体， 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧 光强度与待检抗原含量成反比。
二、免疫荧光试验
（一）原理
用荧光标记物标记病毒抗原或抗体，作为分 子探针，检查细胞或组织内相应的病毒抗体 或抗原。荧光标记物受激发光照射后发光， 用荧光显微镜观察，可确定病毒种类、定位、 定量。
二、免疫荧光试验
（二）类型 荧光抗体法 荧光抗原法 免疫细胞（组织）化学技术
二、免疫荧光试验
四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC)
藻红蛋白（PE）
550nm 490-560nm
620nm（橙红色） 595nm（红色）
FITC的衬比染色或双标 记FAT
双标记FAT、流式细胞术
7-氨基-4-甲基香豆素 354nm
Eu3+螯合物
340nm
430nm（蓝色） 613nm
双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
第二节 酶免疫技术
Enzyme immunoassay
抗原抗体反应特异性 酶高效催化反应专一性
第二节 酶免疫技术
酶
辣根过氧化物酶 HRP
底物
邻苯二胺OPD 四甲替联苯胺TMB 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐
显色反应
橘红色 黄色 棕色 兰色
蓝绿色
测定波长
一、抗原—抗体反应
特异性高 可逆
氢键、范德华力、静电吸引力
可见
抗原-抗体比例适宜，复合物相成团
二、影响反应的因素
电解质
pH≥7时，适当电解质使其结合可见凝集团或沉淀
温度 37℃
温度升高，反应加快 <56℃
酸碱度 pH6~8
接近等电点时易出现假阳性
第一节 免疫荧光技术
Immunofluorescence assay IFA 能解决：是什么 在哪里 有多少
荧光 激发光谱 发射光谱 荧光效率 荧光寿命 荧光猝灭 荧光偏振
第一节 免疫荧光技术
荧光物质
荧光物质
最大吸收光谱
最大发射光谱
应用
异硫氰酸荧光素 (FITC)
490～495nm 520～530nm （黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定
四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 记FAT
二、免疫荧光试验
3.鉴定制成的荧光抗体 以FITC为例
荧光（F）蛋白（P）结合率
调整制备液至A280mm=1
F/P=
2.87×A495mm A280mm-0.35×A495mm
比值越大，抗体结合荧光素越多
二、免疫荧光试验
3.鉴定制成的荧光抗体 测定抗体效价：双向免疫扩散试验 抗体特异性：吸收试验、抑制试验 抗体特异性染色滴度：倍比稀释
二、酶联免疫吸附试验
Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
Leabharlann Baidu
三、免疫荧光显微镜技术
荧光显微镜
利用一定波长的激 发光对样品进行激 发，产生一定波长 的荧光，对样品结 构或其组分进行定 性、定位、定量观 察检测。
三、免疫荧光显微镜技术
光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 光路：透射光、落射光 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 镜头：消色差镜头
二、免疫荧光试验
4.荧光抗体染色 直接法
二、免疫荧光试验
4.荧光抗体染色 间接法
二、免疫荧光试验
4.荧光抗体染色 补体法 荧光标记抗补体抗体 双标记法 两种荧光素抗体检测两种抗原
二、免疫荧光试验
5.设立对照 区分特异性和非特异性染色 标本自发荧光对照 荧光抗体对照 阳性抗原对照 阻断试验
405 420
360,450 420
第二节 酶免疫技术
酶标记
戊二醛交联法
酶
蛋白质
醛基
过碘酸氧化法
过碘酸盐 HRP
HRP 醛基
第二节 酶免疫技术
固相载体 塑料制品 微粒 膜载体 NC膜、尼龙膜
第二节 酶免疫技术
包被与封闭 包被 适宜浓度蛋白质 封闭 二次包被填补空隙
小牛血清
492 460 449 425 642
碱性磷酸酯酶 AP 葡萄糖氧化酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
β-Ｄ－半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG)
黄色 红色
黄色 深蓝色
荧光 黄色
400 500
↓
↓
脱水脱色
冰冻切片
↓
↓
石蜡固定、脱蜡 丙酮固定、干燥
↓ 印片
二、免疫荧光试验
2.荧光抗体制备 制备抗体 用高纯度病毒免疫动物获取血清，分离IgG， 提纯
家兔、绵羊、山羊
高特异性
高亲和力
二、免疫荧光试验
2.荧光抗体制备 标记荧光素 共价键结合 抗体+荧光素
↓4℃持续搅拌数小时 纯化（离心、透析、过滤）
（三）方法 制备标本 制备荧光抗体 荧光抗体染色 荧光显微镜检查
二、免疫荧光试验
1.制作病毒染色标本 培养敏感细胞（细胞爬片）
↓ 种毒 ↓ 固定、干燥 丙酮
二、免疫荧光试验
1.制作病毒染色标本 临床样本（非固型组织） ↓ 涂片 ↓
固定、干燥
二、免疫荧光试验
1.制作病毒染色标本
尸检样品（3~5mm）