学生实验课程讲义米曲霉制作豆豉

“多酶发酵对豆豉风味物形成的研究”
实验项目具体方案
一、实验目的：
本项目拟采用微生物的培养、发酵及发酵物的提取与分离等实验技术，阐明豆豉的制作过程，以及多酶复合发酵对豆豉风味物质的形成相关问题，对学生从事豆豉生产的研究和对相关发酵工艺的流程、工艺参数的优化等方面的科学问题的研究具有重要作用。

二、实验原理
实验分别对纯种发酵豆豉与多酶复合发酵豆豉进行了研究，经过发酵的豆豉,具有独特的风味，其风味物质的形成，除受原料影响外，更重要的是在豆豉制曲及后发酵过程中豉曲产生的各种酶系，除了主要微生物外，都还伴随着其他次要微生物的生长，非单一微生物体系决定了其酶系的多样性，这与参加发酵的微生物种类有着密切的关系。

本实验通过比较多种豆豉成品的风味物质的比例、含量来说明多酶发酵豆豉的特点，以及通过对米曲霉发酵豆豉各阶段的研究，对改进豆豉的加工工艺起着指导作用。

三、实验所需仪器设备及台套数、实验用具与消耗品清单及数量
设备：
721分光光度计1台，超净工作台一个，PH计一个，高速离心机一台，鼓风干燥箱一个，恒温振荡器一台，生化培养箱一只，冰箱一台，显微镜5台，水浴锅5台，磁力搅拌器一台，氨基酸测定仪一台，高压杀菌锅二台。

仪器与消耗品：
培养皿、烧杯、试管、三角烧瓶、离心管、酒精灯、滴管、试剂瓶、量筒、容量瓶、漏斗、烧瓶、玻板、移液管、干燥器、玻璃珠、吸管、滴瓶、比色管
蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、琼脂粉、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、硫酸镁、氯化钠、无水乙酸钠、葡萄糖、硫酸锰、吐温80、CaCO3、磷酸氢二钠
四、实验内容
内容一（8课时）
主要内容：讲解实验原理介绍，教授学生查找资料、设计实验。

中国是大豆的故乡，几千年来，大豆为中华民族的繁衍生息做出了不可磨灭的贡献，而大豆食品也成为中国传统食品中的一朵奇葩。

豆豉与豆酱、酱油、腐乳并列为我国四大传统大豆发酵制品，且自古以来药食两用，迄今还用于几种中药制剂中。

然而豆豉至今仍以自然发酵、作坊式生产为土，对其发酵过程和发酵机理研究甚少。

本试验主要是从自然发酵曲霉型豆豉，在后酵中加入复合酶，研究其发酵特性及风味物的形成。

优化其发酵工艺，并对发酵过程中产品的成分变化及不同复合酶发酵产品的特点进行研究。

豆豉是以黑豆、黄豆为主要原料，利用微生物发酵制成的一种调味食品。

按制曲微生物的不同，豆豉可分为毛霉型、曲霉型、根霉型和细菌型等；按发酵时是否加食盐，分为咸豉和淡豉；按成品含水量多少，分为干豆豉、湿豆豉和水豆豉。

我国主要生产毛霉型、曲霉型豆豉及少量的细菌型豆豉（俗称水豆豉）。

曲霉型豆豉在我国分布最广，由于空气中含有大量的曲霉孢子，所以天然发酵生产的豆豉一般为曲霉型豆豉。

豆豉曲酶发酵工艺：
大豆→清理→浸泡→蒸煮→沥干冷却→自然接种→培养→豆豉曲→水洗→混合→发酵→干燥→豆豉
学生实验记录：
试验时间：试验人员：
试验记录：
主要内容：豆豉种类、成分的测定，进行大豆前处理、蒸煮实验
实验原料：大豆
实验仪器：高压锅
实验步骤：
原料处理
a．原料筛选：择成熟充分、颗粒饱满均匀、皮薄肉多、无虫蚀、无霉烂变质、并且有一定新鲜度的黑大豆为宜。

b．洗涤：用少量水多次洗去大豆中混有的砂粒杂质等。

c．浸泡：浸泡的目的是使黑豆吸收一定水分，以便在蒸料时迅速达到适度变性；使淀粉质易于糊化，溶出霉菌所需要的营养成分；供给霉菌生长所必需的水分。

浸泡时间不宜过短。

当大豆吸收率<67％时，制曲过程明显延长，且经发酵后制成的豆豉不松软。

若浸泡时间延长，吸收率>95％时，大豆吸水过多而胀破失去完整性，制曲时会发生“烧曲”现象。

经发酵后制成的豆豉味苦，且易霉烂变质。

因此，我们在生产加工中应选择浸泡条件为40℃、150分钟，使大豆粒吸收率在82％，此时大豆体积膨胀率为130％。

d．蒸煮：蒸煮目的是破坏大豆内部分子结构，使蛋白质适度变性，易于水解，淀粉达到糊化程度，同时可起到灭菌的作用。

确定蒸煮条件为0.1MPa，15分钟或常压150分钟。

e. 冷却: 摊开自然冷却至35℃左右。

目的是使下一步骤接入的米曲霉可以很快繁殖，以防杂菌生长。

要注意防止冷却过程的污染。

学生实验记录：
试验时间：试验人员：
试验记录：
主要内容：进行接种制曲的实验
实验原料：煮熟大豆，米曲霉（沪酿3.042）
实验仪器：培养皿，恒温培养箱
实验步骤：
制曲
制曲的目的是使煮熟的豆粒在霉菌的作用下产生相应的酶系。

在酿造过程中产生丰富的代谢产物，使豆豉具有鲜美的滋味和独特风味。

把蒸煮后大豆出锅，冷却至35℃左右，接种米曲霉（沪酿3.042），接种量为0.5％，拌匀入室，保持室温28℃，16小时后每隔6小时观察。

制曲22小时左右进行第一次翻曲，翻曲主要是疏松曲料，增加空隙，减少阻力，调节品温，防止温度升高而引起烧曲或杂菌污染。

28小时进行第二次翻曲。

翻曲适时能提高制曲质量，翻曲过早会使发芽的孢子受抑，翻曲过迟，会因曲料升温引起细菌污染或烧曲。

当曲料布满菌丝和黄色孢子时，即可出曲。

主要内容：进行洗曲、拌料的实验
实验原料：制曲大豆，食盐，青矾
实验仪器：培养皿
实验步骤：
洗曲
豆豉成曲表面附着许多孢子和菌丝，含有丰富的蛋白质和酶类，如果孢子和菌丝不经洗除，继续残留在成曲的表面，经发酵水解后，部分可溶和水解，但很大部分仍以孢子和菌丝的形态附着在豆曲表面，特别是孢子有苦涩味，会给豆豉带来苦涩味，并造成色泽暗淡。

拌料
浸焖及加青矾、食盐向洗霉后的豆曲中加入18％的食盐、0.02％的青矾和适量水，以刚好齐曲面为宜，浸焖12小时。

学生实验记录：
试验时间：试验人员：
试验记录：
主要内容：进行豆豉的后酵
实验原料：洗曲后大豆，酶B. subtilis–A，酶B. subtilis–B，酶B. subtilis–C，酶B. subtilis -D，酶B. subtilis -E，酶B. subtilis -F
实验仪器：恒温培养箱
实验步骤：
发酵就是利用制曲过程中产生的蛋白酶分解豆中的蛋白质，形成一定量的氨基酸、糖类等物质，赋予豆豉固有的风味。

各组将洗曲后大豆按比例加入不同的酶B. subtilis -A或酶B. subtilis -B或酶B. subtilis -C或酶B. subtilis -D或酶B. subtilis -E或酶B. subtilis -F，将处理好的豆曲装入罐中至八、九成满，装时层层压实，置于28℃～32℃恒温室中保温发酵。

发酵时间控制在20天左右。

学生实验记录：
试验时间：试验人员：
试验记录：
主要内容：进行豆豉的干燥
实验原料：豆豉
实验仪器：鼓风干燥箱
实验步骤：
发酵成熟豆豉的在鼓风干燥箱进行，通过在不同温度、时间进行干燥，比较干燥条件对豆豉风味的影响。

学生实验记录：
试验时间：试验人员：
试验记录：
主要内容：进行豆豉风味的测定，从感观、理化等指标评价复合酶对豆豉风味的影响
实验原料：干豆豉
实验仪器：氨基酸测定仪、酸度计
实验步骤：
①感官指标
a．色泽：黑褐色、油润光亮。

b．香气：酱香、豉香浓郁无不良气味。

c．滋味：鲜美、咸淡可口，无苦涩味。

d．体态：颗粒完整、松散、质地较硬。

②理化指标
a．水分：≥18.54％；
b．蛋白质：≥27.61g／lOOg：
c．氨基酸：≥0.5g／lOOg；
d．总酸(以乳酸计)≤3.1lg／lOOg,
e．盐分(以氯化钠计)≥14g／lOOg；
学生实验记录：
试验时间：试验人员：
试验记录：
主要内容：进行豆豉微生物指标的测定
实验原料：干豆豉
实验仪器：培养箱
实验步骤：
微生物指标
a．细菌总数：≤lO6cfu／g；
b．大肠菌群：≤30MPN，lO0g；
c．蜡状芽孢杆菌：≤102个／克；
d．致病菌：不得检出
学生实验记录：
试验时间：试验人员：试验记录：
主要内容：进行豆豉的品尝试验。

实验原料：干豆豉
实验步骤：
同学在实验室分组进行品尝，并填写品尝报告单，
学生实验记录：
试验时间：试验人员：试验记录：
内容十（8课时）
撰写论文。