考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量

考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量

实验目的：

学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。

实验原理：

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

新鲜绿豆芽

2．主要仪器

（1）分析天平、台式天平

（2）刻度吸管

（3）具塞试管、试管架

（4）研钵

（5）离心机、离心管

（6）烧杯、量筒

（7）微量取样器

（8）分光光度计

3．试剂

（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。

（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。

（3）乙醇

（4）磷酸（85％）

四、操作步骤

1．标准曲线制作

（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。

低浓度标准曲线制作

2．样品提取液中蛋白质浓度的测定

（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h 以充分提取，然后在4 000r/min 离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL 容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

（2）测定：另取2 支10mL 具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。

度OD

595

以标准曲线1 号试管做空白。

五、结果计算

式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。

实验结果：

测得数据

管号 1 2 3 4 5 6 OD值0 1.5 2.801 4.001 5.104 6.01

标准曲线

测得样品蛋白OD 595nm为3.353

经计算的样品蛋白浓度为54.9318µg