考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量
考马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量的原理
考马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量的原理
马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量是互联网中一种应用广泛的方法，它是一种
特殊的分光光度法，通过紫外可见分光光度法来测定某个蛋白质 HbA1c（糖化血红蛋白）含量。
它能够准确、快速、简便地检测出特定蛋白质的含量，在不同的生物样品中具有显著的抗污染特性，可有效避免干扰因素的影响，从而获得高精度的检测结果。
在马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量的过程中，会使用紫外分光光度法来测定
糖化血红蛋白的含量。
这是因为糖化血红蛋白本身对紫外光有一定的吸收的特性。
当紫外光照射到样本中包含的糖化血红蛋白上时，会使其被分解成不同的肽。
这些肽段会有一定的反应，当在特定波长下照到波长光源上时，就可以由紫外可见分光光度仪测量出糖化血红蛋白含量。
通过比较波长光源的测定值以及未受照射样品的测定值，就可以计算出糖化血红蛋白含量，从而得出蛋白质含量的结果。
马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量具有准确性高、快速、经济、有效性强等特点，已被广泛应用在生命科学研究和临床检测中。
而且，其准确性和敏感度可满足多种档次需求，因此可以用于科学研究和临床医疗诊断等不同领域。
总之，马斯亮蓝g-250法测定蛋白质含量是一种应用广泛的方法，它的准确性、快速、简便、有效性强等特点，使其在生物、临床诊断等多个领域有重要的应用，也是互联网上比较流行的一种蛋白质测量方法。
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用
2．校正 （1）打开吸收池暗室盖，调节[0% T]旋钮， 使数字显示为“00.0”，将参比溶液置于光路， 盖上吸收池盖，调节透光率[100% T] 旋钮， 数字显示为“100.0”。 （2）如果显示不到“100”，则可适当增加电 流放大器灵敏度档数，当改变灵敏度 后必须重 新校正“0”和“100”。 （3）按（1）连续几次调整“00.0”和 “100.0”后，将选择开关置于“A”，调节吸光 度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行 吸光度A的测量.
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋 白质含量：分光光度的使用
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测
定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作
方法。
【实验原理】 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量 属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸 收峰在465nm；当它与蛋白质通过范 德华键结合成复合物时变为蓝色，其 最大吸收峰移至595nm，而且消光系 数更大。
灵敏度
0
100
暗盒盖
调波长旋钮
比色皿拉杆
1．调整
（1） 接通电源。 （2） 调波长调节器至所需波长。 （3） 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置
于“T”，将灵敏度旋钮调至”1”档位，调节透 光率[100%T]。预热20min . 预热仪器应在不测定时，将比色皿暗箱盖打开， 使光路切断。
液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，
4000rpm离心10min，合并上清液并含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
混合,放置5min后，测 A595值。
3. 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋 白含量。
实验8考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
对实验条件进行优化，如调整PH值、反应时间、温度等，以提高实验
结果的稳定性。
03
应用拓展
进一步研究考马斯亮蓝法在特殊蛋白质或不同来源蛋白质测定中的应用，
拓展其应用范围。同时，可以探索与其他蛋白质测定方法的比较研究，
为蛋白质定量分析提供更多选择。
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标准曲线的绘制
加样
将标准蛋白溶液分 别加入相应的试管 中。
测定光密度值
在特定波长下测定 各试管的光密度值， 记录数据。
准备标准蛋白溶液
制备一系列不同浓 度的标准蛋白溶液。
显色反应
向每个试管中加入 适量的考马斯亮蓝 溶液，混合均匀。
绘制标准曲线
根据测得的光密度 值与标准蛋白浓度 绘制标准曲线。
加样
样品稀释
根据实验需求，将蛋白质 样品进行适当稀释，以便 后续测量。
样品标记
对每个样品进行标记，以 便后续结果分析时能够准 确对应。
考马斯亮蓝溶液的配制
准备试剂
储存与使用
按照实验要求准备考马斯亮蓝溶液所 需的试剂。
将配制好的考马斯亮蓝溶液储存于棕 色瓶中，避免光照，使用前摇匀。
配制溶液
将各试剂按比例混合，制备出考马斯 亮蓝溶液。
影响因素
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，PH值、反应时间、温度等因素 可能影响实验结果。
适用范围
考马斯亮蓝法适用于大多数蛋白质的定量测定，但对于某些特殊蛋 白质或不同来源的蛋白质可能存在一定误差。
对实验的改进建议与展望
01
标准化操作
为提高实验准确性，建议对实验操作进行标准化，减少人为误差。
02
优化条件
考马斯亮蓝与蛋白质结合的机制
考马斯亮蓝测蛋白
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G —250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：1、2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
实验六蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G －250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。
蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）分析天平（2）具塞刻度试管10ml×8（3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I（4）研钵（5）漏斗（6）离心管10ml（7）容量瓶10ml（8）离心机（9）721型分光光度计2．试剂（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3．材料绿豆芽四、操作步骤1盖上塞子，摇匀。
放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在l h内完成）。
以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定客至刻度。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量(精)
仪器和试剂
1．仪器：分析天平；吸管0.1ml×1、1ml×2、5ml×1； 试管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml、1000ml各一 个； 2．试剂： （1）0.9% NaCl溶液； （2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于 蒸馏水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯 亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷 酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不宜久存， 在常温中可放置1-2个月。 （4）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液，用 0.9% NaCl溶液稀释至一定浓度。
计算
样品的蛋白质含量（μg/g鲜重）=[查得的 蛋白质含量（μg） / [ 样品鲜重（g）]
注意事项
1. 如果要求严格，最好在试剂加入后的 5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜 色是最稳定的。 2．测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸 附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿 （因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比 色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗， 以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或 丙酮长时间浸泡。
操作步骤
1．0~100μg／mL标准曲线的制作： 取6支试管，编号后，按下表加入试剂， 混匀，室温静置5min后，以管1为空白对照， 在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量 （μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出 标准曲线。
管号
蛋白质标准液 （ml） 0.9%NaCl溶液 （ml） 考马斯亮蓝染液 蛋白质含量（μg）
1
0
2
3456来自0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量实验目的本实验的目的是通过考马斯亮蓝G250法测定蛋白质的含量，并了解该方法的基本原理。
实验原理蛋白质含量的测定方法有很多，其中比较常用的是考马斯亮蓝G250法。
该方法的基本原理是：靶蛋白质与染料考马斯亮蓝G250反应生成蓝色沉淀，通过比色法测定沉淀的吸光度，即可计算出蛋白质的含量。
具体来说，该方法的操作步骤如下：1.将待测蛋白质样品制备成一定的浓度，并加入一定体积的考马斯亮蓝G250试剂。
2.在一定时间内使反应到达平衡，将反应液离心沉淀。
3.由于考马斯亮蓝G250和蛋白质的结合比较强，一般可以近似认为反应液中大多数考马斯亮蓝G250都与蛋白质结合在一起。
因此，剩余的考马斯亮蓝G250浓度可以通过测定上清液的吸光度得到。
4.根据标准曲线（一般为已知浓度的蛋白质样品的吸光度与浓度的对应关系），可以将上清液的吸光度转化为蛋白质的含量。
实验步骤实验前准备准备工具和试剂，包括：•96孔微孔板•分光光度计•移液器、吸头•加样器•蒸馏水•NaOH溶液（1mol/L）•BSA标准品（2mg/mL）实验操作1.准备5个稀释比例的BSA标准品，分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0mg/mL。
2.将标准品和待测样品分别加入96孔板中，每个样品重复3次。
3.加入一定体积（如200μL）的考马斯亮蓝G250试剂，混匀。
4.在室温下暗置约5min，使反应充分发生。
5.离心沉淀至液面完全透明。
6.将上清液吸取到另一个96孔板中。
7.加入100μL NaOH溶液，混匀。
8.制备一条标准曲线，测量各标准品和待测样品的吸光度。
数据处理根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。
实验注意事项•操作时要注意洁净卫生，避免交叉污染。
•要精确控制试剂的使用量，避免误差。
•每项操作要根据标准程序认真进行，做到数据准确可靠。
实验结果分析通过考马斯亮蓝G250法测定了不同浓度的BSA标准品和待测样品中的蛋白质含量，得到了标准曲线和待测样品的吸光度值。
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量_2
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
原理:考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后,染料的最大吸收从465nm变为596nm,蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数,因此蛋白质测定的灵敏度较高,最低检出量为1ug蛋白质.染料与蛋白质的结合,大约只需2min,结合物的颜色在1h内是稳定的.一些阳离子乙醇等物质不干扰测定,但去污剂严重干扰测定,少量的去污剂可通过用适当的对照而消除,犹豫染色法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛用于蛋白质含量的测定.
试剂:○1标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白。
或根据牛血清清蛋白的紫外消光系数来确定
○2蛋白染色剂的配置：取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%愚蠢，假如100ml85%磷酸，将溶液用水稀释到1000ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%磷酸
操作：1.标准曲线的绘制
（1）取7支试管，分别假如0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，
1.4ml，1.6ml标准蛋白质溶液，用水不足到2ml
（2）去8支试管，0号加入0.1ml蒸馏水，1~7号试管一次加入0.1ml步骤（1）的标准蛋白质稀释液，然后各加入5ml
蛋白染色剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收
值。
以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标
准曲线作为定量的依据。
2.样品的测定
去样品溶液0.1ml，用制定标准曲线的方法测595nm光吸度，用标准曲线计算蛋白质的含量。
实验结果
测定所用的标准曲线方程为：v=0．1296x＋0．0907。
考马斯亮蓝G-250法测量蛋白质含量与凯氏定氮法相比较误差范围3％～8％。
考马斯亮蓝G 250法测定蛋白质含量的教学实践及方法学探讨
考马斯亮蓝G 250法测定蛋白质含量的教学实践及方法学探讨考马斯亮蓝G 250法测定蛋白质含量的教学实践及方法学探讨引言蛋白质是生命体内最重要的基本生物大分子之一，它在细胞功能和结构的维持中起着重要作用。
因此，在生物科学教学中，准确测定蛋白质含量是非常重要的。
考马斯亮蓝G 250法是一种广泛应用于测定蛋白质含量的方法，本文将探讨其教学实践及方法学问题。
一、教学实践1. 实验材料和仪器在考马斯亮蓝G 250法的教学实践中，需要准备的材料包括：标准蛋白溶液、试验样品、考马斯亮蓝G 250染液、蛋白质溶液、含蛋白质的胶体、溶胀液和氨水。
2. 实验操作步骤首先，将标准蛋白溶液和试验样品分别制备成一系列浓度的溶液，以便建立标准曲线。
然后，将标准蛋白溶液和试验样品分别与考马斯亮蓝G 250染液混合，在规定的温度下孵育一段时间。
接下来，使用分光光度计测定吸光度，并利用标准曲线计算出蛋白质的含量。
3. 实验结果和分析根据实验数据，可以绘制标准曲线，从而计算出试验样品中蛋白质的含量。
通过对多个样品进行测定，可以得到平均值和标准差，从而评估实验结果的可靠性。
二、方法学探讨1. 优点考马斯亮蓝G 250法具有简单、快速、准确的特点。
它不需要复杂的操作步骤，适合大规模的蛋白质含量测定。
2. 确定标准曲线的方法在实验中，我们可以使用蛋白质溶液来制备一系列的标准样品。
根据各个标准样品的吸光度和已知的蛋白质浓度，可以绘制标准曲线。
在实际操作中，要控制各个步骤的操作条件，如混合时间、孵育温度等，以确保标准曲线准确可靠。
3. 制定实验方案在教学实践中，我们应该根据学生的实际情况和课程要求，制定合理的实验方案。
对于初学者来说，可以首先进行标准蛋白质的浓度测定，并通过对试验样品的测定来巩固相关知识。
结论通过考马斯亮蓝G 250法测定蛋白质含量的教学实践和方法学探讨，我们可以得出结论：该方法简单、快速、准确，适合生物科学教学实践。
在教学中，我们应该注重实验操作的规范化，合理设计实验方案，并根据不同学生的实际情况进行个性化指导。
标准曲线制作考马斯亮蓝法测蛋白质含量(精)
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：1、2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。
因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
考马斯亮蓝测定蛋白含量总结
一原理考马斯亮蓝G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。
在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。
该反应快速灵敏(灵敏度比FolIn－酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
二试剂配置三步骤1破碎细菌提取蛋白液大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
(30% Triton X-100的配制Triton X-100 28.2ml0.1mol/L PBS(pH=7.3)或0.05mol/l TBS(pH=7.4) 72.8ml配制方法取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。
用前取该储备液稀释至所需浓度。
通常将30%稀释到1%。
)注意：在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)
蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法）一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。
蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）分析天平（2）具塞刻度试管10ml×8 （3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I （4）研钵（5）漏斗（6）离心管10ml （7）容量瓶10ml （8）离心机（9）721型分光光度计2．试剂（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
此溶液在常温下可放置一个月。
3．材料绿豆芽四、操作步骤1．标准曲线的制作取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。
管号操作项目 1 2 3 4 5 6标准蛋白质溶液(ml) 0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0G-250试剂(ml) 各5蛋白质含量（μg）0 20 40 60 80 100盖上塞子，摇匀。
放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在l h内完成）。
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
考马斯亮蓝G250染色法测定啤酒中蛋白质含量
果， 见表 ３：
表３
考马斯亮蓝法测定啤酒中蛋白质含量
管号
１
２
３
蒸馏水
１ｍＬ
０
０
酒样（ １ｍＬ）
啤酒 Ａ 啤酒 Ｂ
考马斯亮蓝 Ｇ－ ２５０ 试剂 ３ｍＬ
３ｍＬ
３ｍＬ
ＯＤ５９５ｎｍ 蛋白质含量 ／ｍｇ·ｍＬ－１
０．０００ ０
０．２９２ １．５５
０．２３４ １．１１
ＣＶ％
０
０．５２
０．４７
４ ０ 啤酒 Ｃ ３ｍＬ ０．２５７ １．２８ ０．６８
摘 要： 建立了猕猴桃酒中多酚的 Ｒ Ｐ－ ＨＰＬＣ 检测方法。该方法的最低检测限小于 １．０ｍｇ／ Ｌ， 加标回收率均大
于 ９０％， Ｒ ＳＤ％小于 ６％， 说明该方法准确可靠。用该方法对自制猕猴桃酒中多酚物质进行检测， 得出样品中主
要有： 原儿茶酸、儿茶素、香草酸、咖啡酸、表儿茶素、香豆酸、槲皮素等 １３ 种多酚物质。
０．４
０．３
Ａ５９５
０．２
０．１
０ ０．２
０．４
０．６
ＳＤＳ 浓度 ／％ ０．８
图 ３ 考马斯亮兰 Ｓ ＤＦ 干扰曲线 ＳＤＳ 是分离 ＤＮＡ 时常用的一种阴离子除垢剂， 它的主要 作用是溶解膜蛋白及脂肪， 从而使细胞膜破裂； 溶解核膜和核
小体， 使其解聚， 将核酸释放出来； 能够与蛋白质结合形成
Ｒ－ Ｏ－ ＳＯ３－ …Ｒ＋－ 蛋白质复合物， 使蛋白质变性沉淀。 由图 ３ 可以看出， 十二烷基硫酸钠对考马斯亮蓝测蛋白
试管中， 按表 ２ 取样。盖塞以后， 将各试管中溶液纵向倒转混
合， 放置 ２ｍｉｎ 后用 １ｃｍ 光经的比色杯中在 ５９５ｎｍ 波长下比
色， 记录各管测定的光密度 ＯＤ５９５ｎｍ， 并做标准曲线， 见表 ２。
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考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量
实验目的：
学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。
实验原理：
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
新鲜绿豆芽
2．主要仪器
（1）分析天平、台式天平
（2）刻度吸管
（3）具塞试管、试管架
（4）研钵
（5）离心机、离心管
（6）烧杯、量筒
（7）微量取样器
（8）分光光度计
3．试剂
（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇
（4）磷酸（85％）
四、操作步骤
1．标准曲线制作
（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
低浓度标准曲线制作
2．样品提取液中蛋白质浓度的测定
（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h 以充分提取，然后在4 000r/min 离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL 容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。
（2）测定：另取2 支10mL 具塞试管，按下表取样。
吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。
度OD
595
以标准曲线1 号试管做空白。
五、结果计算
式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。
实验结果：
测得数据
管号 1 2 3 4 5 6 OD值0 1.5 2.801 4.001 5.104 6.01
标准曲线
测得样品蛋白OD 595nm为3.353
经计算的样品蛋白浓度为54.9318µg。