产前遗传学诊断技术研究进展

产前遗传学诊断技术研究进展潘虹1　陈倩2（1.北京大学第一医院　实验中心，北京　100034 ；2.北京大学第一医院　妇产科，北京　100034）·专题笔谈·2012年9月发布的《中国出生缺陷防治报告（2012）》中报告，我国出生缺陷率大约为5.6%［1］。

遗传病是引起出生缺陷的重要原因。

由于遗传病常常在生命的早期就有所表现，如染色体数目或大片段的结构异常，影响胚胎正常发育，引起胎停育；染色体小片段的结构异常或一些单基因病可能影响不同器官的正常发育和功能，引起宫内影像检查时可见的结构畸形或胎儿生长受限等。

一部分疾病通过准确的产前诊断方法能够得以诊断，通过遗传咨询父母有机会选择性生育，从而避免或减少有严重出生缺陷的胎儿出生。

这是目前降低出生缺陷的有效方法之一。

相对而言，染色体异常是孕期最常见的遗传学问题，染色体核型分析技术是最广泛和普遍使用的产前遗传学诊断技术。

此外，与染色体数目异常和几种常见的染色体微缺失和微重复综合征相关的快速分子诊断技术，如荧光原位杂交、荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和BoBs（BACs-on-Beads）等作为辅助技术也被广泛应用。

近些年，随着基因组医学（genetic medicine）的蓬勃兴起以及相伴随的分子遗传学检测技术的快速发展，遗传病的产前诊断取得了很大的进步，更多罕见的微缺失微重复综合征和复杂的单基因病得到诊断。

了解不同遗传学检测方法的特点和区分不同方法之间的差别有助于正确选择最恰当的检测方法，更有效的应用于产前诊断的实际工作中。

近十年来为遗传病诊断做出巨大贡献的技术是染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）和二代测序（next generation sequencing，NGS）技术。

1 CMA CMA是全基因组分析，也称分子核型，无需筛选靶向，是目前检测基因组拷贝数变异（copy number variant，CNVs）的最好方法。

CNVs指大小在1 kb～5 Mb之间的DNA片段，光学显微镜下不可见。

CNVs广泛存在于基因组中，本身不具有临床意义，可以增加或减少（重复或缺失）。

致病性CNVs引起微缺失微重复综合征。

CNVs引起的疾病与基因组序列有关，与染色体非整倍体异常不同，不随母亲年龄的增长而增多，因此，任何年龄段的孕妇均存在风险［2］。

CMA有两类平台，一类基于比较基因组杂交（array-based comparative genomic hybridization，aCGH），分别用红绿二色荧光素标记等量的待测和对照DNA后与芯片上的互补探针序列杂交，比较荧光颜色的密度识别CNVs。

另一类利用人类基因组存在的大约3×106个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）的特性，用单色荧光标记待测DNA样本与芯片杂交，通过荧光强度的变化确定数百万个多态性位点的基因型并分析CNVs。

SNP-array除检出CNVs外还可以提示杂合性丢失（loss of heterozygosity, LOH）。

LOH可能提示单亲二体（uniparental disomy，UPD），如果LOH的DNA片段存在印记基因，则存在印记相关DOI：10.3969/j.issn.2095-5340.2019.03.002通讯作者：潘虹（Email：panmuren@）遗传病风险；如果LOH源于有亲缘关系的父母，在这个LOH DNA片段又存在隐性遗传病的致病基因突变，则存在隐性纯合子患病风险。

SNP-array 还能检出三倍体和嵌合体等。

目前aCGH也加入了SNPs位点，使两种芯片在应用上无差别。

用于临床检测的芯片多采用靶向和全基因组混合设计，即在已知综合征和致病基因位点设计高密度的探针，在骨架区覆盖低密度探针［3-4］。

2004年，Tachdjian等［5］首次报道了aCGH 在产前诊断中的应用，证实了胎儿染色体核型46,X,Xq + 中异常染色体的来源。

2005年，Le Caignec等［6］报道了用aCGH检测产前诊断中的系列病例，检出了染色体核型正常而有明确致病性CNVs病例。

其后，来自多中心研究表明：在常规妊娠的胎儿中，致病性或可能致病性CNVs的发生率为 1.7%，如果胎儿伴有结构异常，则CNVs的发生率为6%［7］，主要结构异常包括心脏、骨骼系统、泌尿生殖系统、肾脏、唇腭裂和中枢神经系统异常［8］。

这些结果提示孕期胎儿超声异常的孕妇，如果随后进行侵入性操作应当接受CMA检测。

美国妇产科学会（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）和母胎医学学会（Society For Maternal Fetal Medicine，SMFM）发表的相关共识几经修改，2016年版建议因各种原因进行侵入性检测的孕妇均可行CMA；产前超声检查发现胎儿结构异常时建议CMA作为主要检查方法，可以替代染色体核型［9］。

为帮助孕妇和家属了解CMA 检测的意义，在进行CMA检测前和检测后均需要进行专业的遗传咨询。

2014年，我国专家发表的CMA共识中提出超声检测异常而染色体核型正常作为行CMA检查的主要适应证［10］。

CMA技术也有局限性：不能检出染色体的平衡性改变，如染色体相互易位或倒位等；相对罕见的新生性平衡变异，可能遗漏因断点扰乱基因结构而引起的先天性异常；不能显示增多片段的染色体定位；检出约1.5%不明意义的变异（variants of unknown significance，VOUS），如CNVs不含基因、含未知功能的基因或易感性位点外显不全等，VOUS 可能引起双亲焦虑和无充分证据而终止妊娠；CMA检出无致病意义的CNVs显著多于常规染色体核型的多态性。

CMA正在成为产前诊断中最常用的检测方法，在遗传咨询的前提下，如因各种原因接受有创性产前诊断者或孕期影像学检查发现胎儿结构等异常者均可以建议接受CMA检测。

2　NGS NGS是一种高通量基因测序技术，有快速、自动化和大规模平行测序的优势。

NGS可同时对多个DNA片段或其扩增产物进行测序。

为更全面的产前基因诊断提供了新的希望。

2.1　NGS用于无创性产前检测（noninvasive prenatal testing/screening，NIPT/NIPS）　NIPT 是一种筛查技术，利用母血中存在胎儿游离DNA （cell-free DNA，cfDNA），结合NGS技术和生物学信息分析得到胎儿遗传信息的检测方法。

在大多数国家，NIPT用于检测胎儿常见染色体非整倍体异常（21、18、13三体或性染色体），与血清学筛查相比有更高的敏感性和特异性以及更低的假阳性率［11-14］。

目前尚无专家共识或指导意见用于染色体结构重排、微缺失微重复综合征和罕见的其他常染色体三体的检测。

胎儿cfDNA是胎盘滋养层细胞在凋亡过程释放出的DNA片段，随胎盘血液循环进入母体，其包含胎儿的全基因序列，理论上，NIPT存在对胎儿全部染色体基因组进行分析的可能性［15］。

因此，通过更多的对比研究和多中心大样本总结可以进一步扩展到更广泛的染色体异常检测［16-18］。

资料显示：CNVs引起微缺失微重复综合征虽然每病种相对较少见，但它们共同代表了一组重要的染色体疾病，占新生儿所有先天性异常的1%～2%；同样在产前诊断中发现宫内未见发育异常的胎儿仍然有1%～1.7%携带染色体异常［19］。

最近，Liang等［20］用扩展的NIPT（NIPS-Plus）检测常见非整倍体异常和微缺失微重复综合征，显示最常见的22q11.2微缺失的阳性预测值高达93%，15q11.2-q13缺失的阳性预测值为75%，其他染色体片段异常占20%～50%。

因此，认为NIPS-Plus可以作为第一线的孕期筛查方法，以增加临床有意义的染色体异常的检出率。

根据NIPT的工作原理，单基因病也可以作为筛查对象。

但是受cfDNA片段化、检测复杂性、患病个体相对较少以及致病突变谱广的影响，NIPT在单基因疾病筛查的临床应用上进展相对缓慢。

早期研究主要关注父源传递的变异或新生性常染色体显性遗传病的单一位点突变分析，随着NGS的广泛应用和经验的积累，筛查其他类型遗传方式的文章陆续发表。

Chitty等［21］将突变分析扩展到多位点，NGS靶向捕获包含FGFR3基因的29个已知突变；Parks等［22］将相对单倍型剂量分析方法（relative haplotype dosage analysis，RHDO）用于X-连锁的隐性遗传病 Duchenne型肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）的检测，通过选择DMD基因周围高度杂合的SNPs位点构建基因单体型，用男性先证者的SNPs推断受累者的单体型，然后对母体单体型进行分析并计算母体血浆中各单倍型的低表达或过表达，在cfDNA浓度大于4%时其检测的精确性可达100%，他们也同时强调检测的精确性与突变位置有关。

RHDO 还被用在基因组存在假基因干扰而不能直接测序的常染色体隐性遗传病上，如先天性肾上腺皮质增生症和脊肌萎缩症等。

NIPT目前是最有效的筛查方法，随着NGS和生物信息学的进步以及更大量病例的临床研究，其将扩展到更多的遗传病病种，筛查的检出率、特异性、阳性预测值也将越来越高。

需要强调，NIPT是一种遗传病筛查技术，凡是提示高风险的孕妇均要接受有创性产前诊断来明确诊断。

2.2　全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）和全外显子测序（whole exons sequencing，WES）　WGS 检测全基因组序列，分辨率最小1 bp。

测序包括蛋白编码区的外显子（exons）和非编码区的内含子（introns）。

一般认为内含子的临床相关性小而测序花费大，同时测序量巨大、阐述结果复杂，因此更多的临床检测主要集中在WES，即主要对具有编码功能的外显子测序。

人类基因组中大约有22 000个基因，外显子占全基因组的1.5%，大约涵盖致病性突变的85%。

WGS/WES主要用于诊断单基因遗传病，与一代测序有靶向基因不同，它无需特异靶向。

单基因遗传病遵循孟德尔遗传规律，多数致病性突变与基因外显子变异相关。

WGS/WES在诊断不明原因的成人患者和病因不明的多发出生缺陷或精神、神经发育障碍患儿的诊断中发挥了重要作用，依据受累的系统诊断率为25%～30%［23-24］。

在产前诊断的病例中，虽然使用CMA后增加了异常胎儿的诊断率，但仍然有2/3的胎儿异常得不到遗传病因的诊断［25］。