电镜样品的基本制备技术之负染色技术

（四）样品的均匀分散性 在进行负染 时，经常发生颗粒悬浮样品的凝集现像。 此时，染色剂与样品形成电子不能穿过的 团块，致使无法看清样品的微细结构。造 成上述现象的主要原因，是悬浮样品不易 在铜网上展开而形成的一种团聚现象。
（二）漂浮法
先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上， 再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠 上漂浮以沾取样品；然后，用滤纸吸干铜 网上的多余悬液，再将铜网在染液滴珠上 漂浮，时间１－2分钟，最后再用滤纸将染 液吸干即可观察。
四、影响负染效果的有关因素
（—）掌握染色时机 染色应在铜网上的 悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如 果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染 色，则严重影响染色效果，便得不到理想 的负染电镜图像。
负染色技术首先，由Ha11（1955）、 Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生 物学研究中得到了越来越广泛的应用。负 染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超 薄切片等复杂操作，而是直接对沉降的样 品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术 相比，该技术具有操作简便、用药量极少、 省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于 细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及 分离的细胞器等研究工作。
１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到 6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH 为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解 需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液， 使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。
作为负染色剂的条件： （l）具有较高的电子密度和较强的电子 散射能力； （2）耐受电子束的轰击、在电子束照射 下不升华； （3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构； （4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样 品不发生化学反应，易在不规则样品表面 渗透。
（三）样品的纯度和浓度
样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如 果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培 养基残渣Fra Baidu bibliotek盐类结晶等），会对负染色效果产生 干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外， 悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成 电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会 造成样品堆积而影响观察。因此，要求滴样时应 做各种稀释度的对比观察。
（三）离心提纯法
用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或 细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。 先用低速离心（3000转／分），弃去较大 杂质和细胞碎片．再用适当孔径的滤膜过 滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉 淀物制成悬液滴样染色。
二、染液的配制
一般均由重金属盐配制。最常用的有 磷钨酸（PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨 酸钠（NaPT）、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵 等。当使用磷钨酸或磷钨酸盐时，可用蒸 馏水或磷酸缓冲液配制成0.5％～3％的溶 液，染色前应用：
2．低渗释放法 从培养瓶中刮下所 培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁 上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水 的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗 破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次， 再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液 滴膜染色。
3．抗体 病毒凝集沉淀法 某些病毒 如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒 及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体 形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓 缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找 到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于 病毒疾病的快速诊断。
（二）控制pH值 悬浮液与染液的pH值对 负染效果有着明显影响，一股应使悬液呈中性或 略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有 足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液 或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。
特别是磷钨酸染液的pH对病毒染色的影响更 为显著，较酸的染液对病毒负染可产生较好的效 果，而染液越是偏碱，其染色效果越差。染液的 酸碱度不仅可影响染液的扩散，而且也会影响到 病毒的结构。
（—）浓缩取样法
适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。
１．红细胞吸附法 主要用于粘液病毒 和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将 病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟， 使病毒吸附于红细胞表面；
而后，以800转／分速度低速离心15分钟， 使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最 后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于 室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可 从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶 液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。
（二）直接取样法
对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、 水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱 疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支 持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。 此法主要用于临床快速诊断．
对于生长在固体培养基上的微生物， 可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释 成悬液，即可滴样，待稍干后染色观察。 对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采 用直接取样法。
三、负染色操作方法
（—）滴染法
将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸 取，滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液 内样品的浓度,立即或放置数分钟后，用滤 纸从液珠边缘吸去多余液体，即可滴上染 液，染色时间1～2分钟．而后即可用滤纸 吸去染液，待干燥后即可电镜观察。
注意事项： （l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液 滴离开吸管后自然滴下，否则液滴易将铜 网吸起；（2）支持膜应完好无损，吸管不 能太粗，液滴不能太大，否则都不能形成 良好的液珠；（3）病毒在液滴的边缘分布 较多，操作时不宜用滤纸吸干，而任其自 然稍干后再加染液。
负染色又称阴性反差染色，它是利用 高密度的、且在透射电镜下又显示结构的 重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生 物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出 呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染 色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正 染色相反，其样品结构为透明浅色，而背 底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色 的机制，目前还不够清楚。
特别是在病毒学领域，负染色 更能发挥其独到作用，是一项很重 要的实验技术。
—、负染样品的制备
负染色所用的样品，全部取自悬浮液。 在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度 和纯度，这样才能与染色剂之间产生特异 和清晰的结合反应。操作时，将带有样品 的悬液，滴于带有支持膜的铜网上，染色 处理后即可进行电镜观察。其全部制备过 程分述于下。