第六章 花药与花粉培养

小的多细胞团
植
胚状体
株
DNA复制
2 两种营养核
发生融合
发育
2n、3n或4n胚状体
只见于南洋金花中
4、花粉均等分裂途径
花 均等分裂 营养核 粉
生核核
营养细胞
多次分裂
发育
生殖细胞
多细胞团
愈伤组织
单 倍 体
胚状体 植
株
这个途径在南洋金花中相当普遍
第三节 花药培养
概念： 花药培养（anther culture）：指用无菌操作
优点：
在于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是 单倍体植株，不会因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成体细胞植 株。
花粉是研究细胞分化条件、胚胎发生和形态发生机制的较为理想的材料。建 立花粉培养实验系统也可为深入开展细胞工程、遗传工程和分子生物学的研 究提供技术基础。
一、花粉培养的一般操作程序
• 花粉培养与花药培养的一般操作程序基本相同。 • 花粉培养在材料消毒后要将花粉从花药中分离出
来，再进行接种，其基本操作程序可参照花药培 养。
二、花粉的分离方法
自然散落法
把花药从未开的花中在无菌条件下取出，直接插接在无菌培养 基上，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药， 让花粉继续培养生长。如果是液体培养基，可接种大量花药， 经1～2天，大量花粉散落入培养基中，经离心浓缩收集，再 接种培养。
琼脂浓度一般以花药有1/3浸入而又不沉没于琼脂中为宜。
液体培养法
液体培养的培养基厚约0.5cm,若能让花药漂浮在液 面上,效果最好。
加入聚蔗糖(Ficoll),可使花药不下沉而漂浮在液面 上。
第四节 花粉培养
含义：
花粉培养(pollen culture)是指把花粉从花药中剥离出来，在无菌的人工环境 中，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养使其进一步生长发育的技术。
机械挤压法
优点：操作简便 缺点：花粉中混杂有体细胞并且所得的悬浮液中花
粉密度也不易控制。
三、花粉培养的方法
直接培养法
从未经任何预培养或预处理的新鲜花药中分离花粉粒，直接接种到培 养基中进行培养的方法为直接培养。
预培养法
将花药在基本培养基中预培养3～6天，然后取出花粉，经离心冲洗后， 在液体培养基中进行培养，密度为105个/ml。培养三周后，可见到各 个阶段的花粉胚；4～5周后，可发育成小植株。
常见的植物：烟草、大麦、光叶曼陀罗、小麦、小黑麦和辣椒
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2、生殖细胞发育途径
营养细胞
完全不再分裂
只分裂有限几次即停止
单
多次分裂
生殖细胞
多细胞团
发育
愈伤组织 胚状体
倍 体 植
株
只在天仙子中出现
3、营养细胞和生殖细胞并进发育途径
有两种情况
多次分裂
营养细胞
大的多细胞团
愈伤组织 单
1
同时发育
倍
体
多次分裂
生殖细胞
第一期:四分孢子形成期
第二期:单核期 特点：特化的细胞壁逐渐形成。 可分为：单核早、中、晚（靠边） 第三期：双核期
第四期：三核期
二、花药培养时花粉发育途径
1、营养细胞发育途径（A型）
花粉 生殖核（小）------不分裂或分裂几次后退化 营养核（大）-----经多次分裂而形成多细胞团，并迅速增殖
而突破花粉壁，细胞持续分裂形成类胚体或愈 伤组织，最后形成单倍体植株
5.接种
• 在无菌接种室或超净工作台上进行接种操作， 采用直径3cm的试管，每管接种花药30～60粒。
• 必须注意：在操作过程中，不应使花药受到损 伤，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体的 愈伤组织。损伤的花药要淘汰。
6.脱分化培养
• 根据材料不同，选取适宜的基本培养基、 适当的生长素比例和最适的温度进行培养， 经10～30天可诱导愈伤组织形成。
MS培养基、N6培养基和马铃薯2号培养基。 Sunderland(1984)设计了C17培养基，用于水稻、小
麦、大麦、小黑麦、黑麦、玉米和甘蔗等禾谷类作物 的花药培养。
2.材料选取 不同植物花药培养的合适花粉发育时期
植
物
种
减数分裂 中期
减数分裂 晚前期
四分体
水
稻
小
麦
玉
米
油
菜
大
麦
番
茄0
茄
子
辣
椒
拟南芥菜
0
甘
蓝
苹
果
葡
萄
烟
草
0
小黑麦
小黑麦×羊
茅
杨
树
单核期
0 0 0 0 0
0 0
0 0 0 0 0
0
双核期
0 0
成熟期
0 0
3.材料预处理
• 低温： • 高温 • 生长素 • 其他方法处理 常能提高愈伤组织和苗分化的频率。
4.材料消毒
取回的材料，在接种前进行表面灭菌，一般 用70～75％酒精，将表面擦洗即可。
技术将成熟或未成熟的花药接种在人工培养 基上，诱导花粉单性发育形成植株的过程。
一、花药培养的一般操作程序
1.培养基的选择 2.材料选取 3.材料预处理 4.材料消毒 5.接种 6.脱分化培养 7.再分化培养 8.花粉植株移植 9.染色体加倍
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1.培养基的选择
Nitsch H、MS被广泛用于双子叶植物的花药培养。 B5：被广泛用于十字花科及豆科植物的花药培养。 禾谷类植物的花药培养，早期多采用Miller培养基、
7.再分化培养
• 愈伤组织增殖到1～3mm大小时，应及时进 行再分化培养以获得花粉植株。
• 要选择含适当激素水平的培养基进行培养， 约经20～30天就能诱导苗的分化。
8.花粉植株移植
• 当花粉植株的根系生长良好时，就要及时 进行炼苗并移至苗床或大田。
• 试管中花粉植株的移植是一个由异养转变 为自养的过程，必须细心管理，保持幼苗 的水分平衡和促进新根的发生。
第六章 花药与花粉培养
第一节 概述
图8.1 花药（A）和花粉（P）培养的雄核发育和单倍体植株的各种方式图解
第二节 小孢子的形成和花粉的发育途径
一、小孢子的正常发育
二、花药培养时花粉发育途径
1营养细胞发育途径（A型） 2生殖细胞发育途径 3营养细胞和生殖细胞并进发育途径 4花粉均等分裂途径
一、小孢子的正常发育
看护培养法
先把植物的完整花药放在半固体琼脂培养基表面，然后在花药上覆盖 一张滤纸小圆片，用移液管吸取0.5ml花粉悬浮液，密度是每毫升含 有20个花粉粒，滴在滤纸圆片上，置于26℃下培养。
9.染色体加倍
• 人工方法：用0.02～0.4%秋水仙素处理植 株，双子叶植物处理生长点或腋芽，禾本 科植物在分蘖期处理。
• 单倍体植株可以通过自发的核内有丝分裂 产生的二倍体。
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二、花药培养的方法
琼脂固体培养法
在培养基中加入0.5～0.7%琼脂，使培养基呈半固体状态。加 入的琼脂量因琼脂质量而定。