红掌组培过程中外植体褐化问题的解决措施
解析植物组织培养中褐变现象的产生机理及克服方法
2019年第12期作者简介：薛棪（1996-），女，湖北恩施人，本科学历，研究方向：专业植物科学与技术。
收稿日期：2019年11月7日。
试验研究引言褐变现象对植物的生长具有极大危害，是植物组织培养实践中的重难点问题。
据此，为了提升植物组织培养的顺利运行，降低植物体因褐变现象而衰弱或死亡的情况发生，我们有必要对植物组织培养中褐变现象的产生机理与客服方法进行讨论解析。
1植物组织培养中褐变现象的产生机理植物组织的褐变现象可由产生机制的差异分为非酶促褐变与酶促褐变两种。
其中，所谓“非酶促褐变”，即没有酚类底物的干预，植物体本身由于缺水、衰老、寒冷等原因而发生的细胞死亡，如苹果因过度成熟而形成褐变、荔枝因失水pH 值持续上升而形成的褐变等。
所谓“酶促褐变”，即在酚类底物的干预之下，经过酶催化而引发的褐变，此类褐变现象在植物组织培养中出现的几率较高。
从产生机理来看，酶促褐变的出现与酶、酚类底物、氧气三个要素息息相关。
经业内长期的研究与实践发现，引起植物组织褐变现象的酶主要有多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶以及过氧化物酶三种，其中尤以多酚氧化酶最为常见。
引起植物组织褐变现象的酚类底物主要有苯基羧酸、苯丙烷衍生物以及黄烷衍生物三种。
若植物组织处在健康的生长状态时，即便其体内同时存在酶、酚类底物与氧气，通常也不会出现褐变现象。
究其原因，主要是酶与酚类底物分布区域不同，前者多处在细胞的液泡中，而酚类底物则处在细胞质及细胞间质中。
但植物组织健康的细胞结构被打破、细胞膜出现破损时，酶与酚类底物便保有了接触的条件，进而在氧气的催化作用下形成醌，导致细胞出现脱水、聚合等异常反应，最终生成黑褐色的病变物质，引发植物组织的褐变现象。
此外，经相关学者对金花梨、苍溪梨等植物的研究发现，褐变现象的出现几率、发生程度存在一定规律性，与酶的活性和酚类底物的含量相关[2]。
2植物组织培养中褐变现象产生的影响因素2.1植物本身的影响第一，植物的类别及品种的影响。
组织培养褐化原因以及防止措施
褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。
在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。
而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。
因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。
(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。
一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。
多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。
2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。
因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。
3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。
即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。
4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。
例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。
植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。
培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。
组织培养褐化原因以及防止措施
褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。
在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。
而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。
因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。
(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。
一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。
多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。
2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。
因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。
3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。
即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。
4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。
例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。
植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。
培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。
植物组织培养中褐变机理和防治措施
植物组织培养中褐变机理和防治措施摘要：褐变现象是指组织培养诱导脱分化或再分化的过程中，外植体组织从表面向培养基释放褐色物质而使得培养基逐渐变成褐色，外植体随之褐变死亡的现象，褐变现象又称酚污染，在植物组织培养过程中经常出现。
对诱导外植体的脱分化和培再分化过程的影响非常大，甚至是影响某些植物组织培养成功与否的关键。
褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。
褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。
本文对褐变的影响因素和对策进行了研究。
关键词：组织培养，褐变，影响因素1. 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.1褐变类型及基因型物种及其基因型对褐化的影响。
植物组织培养过程中外植体的褐化主要由多酚氧化酶作用于酚类物质而引起的。
不同植物品种、同种植物的不同类型因为外植体材料的基因型不同，在组织培养中褐化发生的频率和程度都存在着较大的差异[4]。
由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，木本植物、单宁含量或色素含量高的植物酚类物质含量也很高，木质素、单宁或色素形成多，其组织培养就容易发生褐变。
因此，组织培养过程中，木本植物一般比草本植物易发生褐变。
目前报道发生褐变的植物中多数是木本植物[5]。
在木本植物中，核桃、板栗由于单宁含量很高，进行组织培养难度很大，不仅在接种后的初代培养期容易发生褐变，而且在形成愈伤组织以后也会因为褐变而引起死亡。
红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。
豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。
在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。
植物组织培养中的褐变现象及其防止措施
植物组织培养中的褐变现象及其防止措施摘要：细胞受损后，由于细胞区隔作用被破坏，毒性酚类或其氧化物醌类物质毒害细胞，导致组织褐变，植物组织培养过程中培养低效或失败。
目前认为组织培养中褐变程度主要受外植体材料的基因型、生理状态、种类、大小、预处理、培养条件、培养基及培养方式的影响。
在目前的研究中控制褐变的有效方法主要有低温培养、暗培养、勤转种、添加抗氧化剂、增效剂或吸附剂于培养基中等。
关键词:植物;组织培养;褐变;防治方法褐变是植物组织培养中一种普遍存在的现象，是由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质，这种褐变现象又被称为酚污染。
多酚类物质及其氧化物醌类物质会抑制其它酶的活性，从而毒害整个外植体，严重影响外植体的脱分化、再分化和生长。
褐变这种现象与菌类污染和过度含水化(即玻璃化)并称植物组织培养的3大难题。
目前褐变已成为植物组织培养发展的一大障碍[1]。
1褐变现象的原因1.1 非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。
诸多不利条件都可以造成细胞的程序化死亡，但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。
1.2 酶促褐变多数认为，植物组织培养中的褐化现象主要是由酶促褐变引起的，即由多酚氧化酶( P PO，Polyphenol Oxidase)作用于天然底物酚类物质而引起的。
在正常条件下,细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡,醌类物质水平较低;而酚氧化酶及其底物分布在正常组织的不同部位，酚类物质分布在细胞的液泡内，酶则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来；但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境，或细胞受伤或衰老时，细胞膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏会导致酚氧化酶释放或合成，如果此时在合适的pH和温度等条件下，酚氧化酶、酚类(底物)和氧发生酶促氧化反应，形成有毒的棕褐色醌类物质,从而使组织发生褐变。
组培苗褐化现象最有可能的原因和防止措施
组培苗褐化现象最有可能的原因和防止措施褐变又称褐化，是指培养材料向培养基释放褐色物质，致使培养基逐渐褐变，培养材料也随之变褐甚至死亡的现象。
其机理是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞内的酚类化合物聚合成暗黑色的大分子物质。
培养材料褐化所产生的醌类物质当扩散到培养基后，会抑制其他酶的活性，导致代谢功能紊乱，从而影响离体材料的培养。
引起褐变的条件是：O2、酶、底物，缺一不可。
酶主要是多酚氧化酶，底物主要是醌类化合物.1 引起褐变的原因1。
1 植物的种类和基因型不同植物、同种的不同类型、同种的不同品种的植物发生褐变的程度,都具有很大的差异,这取决于植物体内含有的酚类物质多少以及酚氧化酶活性的强弱.1。
2 外植体的类型和生理状态由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶活性在不同季节不相同，一般在生长季节含有较多的酚类化合物，所以一般在早春或秋季取材.通俗的说长的久又老的部位含酚类物质要多，所以一般选取幼龄嫩茎部位作为外植体。
1.3 外植体的大小和消毒时间部分实验证明,外植体材料越小越容易发生褐变，同样各种化学消毒剂消毒时间过长也会加重褐变现象，特别是酒精，时间不宜过长。
还有外植体的切口大小也会影响褐变,切口宜小不宜大。
1.4 光照和温度光照会提高多酚氧化酶的活性,从而促使培养物的褐变.故在初代培养中，对外植体进行暗光培养，对抑制褐变发生有一定的效果。
同时，高温能促进酚类物质的氧化；低温能抑制酚类物质的合成，降低多酚氧化酶的活性，从而减轻褐变。
所以，如有褐变情况的发生，可适当降低培养温度，以及遮光或暗光培养一段时间。
1.5 培养基成分无机盐以及细胞分裂素浓度过高也会影响褐变。
2 克服褐变现象的措施2。
1有产生褐变的原因可知，选择适宜的外植体以及最佳培养条件,可从根本上减少褐变的概率。
2。
2连续转移。
对于容易褐变的材料可间隔2—24小时培养后，再转瓶，这样联系处理7-10天后,褐变现象会得到控制或大为减轻。
植物组织培养中的褐变现象及其防止措施
04
褐变现象的研究进展
褐变与基因表达的关系
总结词
褐变与基因表达之间存在密切关系，一些关 键基因在褐变过程中被激活或抑制，影响植 物组织的褐变程度。
详细描述
在植物组织培养过程中，褐变通常与某些基 因的表达水平有关。这些基因可能涉及到酚 类物质的合成、代谢和运输等过程。通过深 入研究这些基因的表达模式，可以更好地理 解褐变现象的分子机制，并寻找有效的防止 措施。
添加抗氧化剂
总结词
在培养基中添加抗氧化剂可以有效防止褐变。
详细描述
抗氧化剂可以抑制酚类物质氧化，从而减少褐变的发生。常用的抗氧化剂包括 抗坏血酸、柠檬酸、硫代硫酸钠等。在培养基中加入适量的抗氧化剂，可以有 效降低酚类物质的氧化程度，从而防止褐变。
调节光照和温度
总结词
调节光照和温度也是防止褐变的措施之一。
详细描述
光照和温度对植物组织培养中的褐变也有影响。适当降低光照强度或缩短光照时间可以减少酚类物质 的氧化，从而降低褐变发生率。同时，保持恒定的培养温度也有助于防止褐变的发生。
优化培养条件
总结词
优化培养条件是防止褐变的综合性措施 。
VS
详细描述
除了选择适当的培养基和外植体、添加抗 氧化剂、调节光照和温度等措施外，优化 培养条件也是防止褐变的重要措施。这包 括控制培养室的湿度、定期更换新鲜的培 养基、及时转移生长过快或过慢的植株等 措施。通过综合运用这些措施，可以有效 降低植物组织培养中的褐变发生率。
05
结论与展望
研究成果总结
褐变现象的机制
植物组织培养中的褐变现象是由多种因素引起的，包括酚类物质氧化、酶促反应和非酶 促反应等。这些反应导致培养基颜色变深，影响植物的正常生长和发育。
论植物组织培养褐变产生的因素及对策
论植物组织培养褐变产生的因素及对策植物组织培养是指将植物体中的一种或几种组织或细胞分离和培养在含有适宜营养成分和生长调节剂的培养基中，使其继续生长、分化和增殖的技术。
这种技术广泛应用于植物育种、植物生产、植物品种改良等方面。
然而，在植物组织培养过程中，褐变现象是一种常见的问题，严重影响了培养细胞的生长表现和生产效率。
因此，本文对植物组织培养褐变产生的因素及对策进行了详细的探讨。
一、植物组织培养褐变产生的因素1. 细胞或组织质损伤：在分离组织和细胞时，过度的力量和操作方法可能会导致组织褐变，这是由于细胞膜、内膜或细胞壁的破裂，导致物质泄漏进入外部环境所致。
2. 呼吸引起的氧化：在植物组织培养过程中，呼吸是组织代谢的基本现象，它产生的能量用于细胞代谢和细胞分裂。
然而，呼吸不充分或呼吸能力不足可能会导致氧化酶的活性增强，导致产生了过多的氧自由基，导致组织褐变。
3. 培养基中的不完整培养物质：培养基的配方以及培养过程中不完整培养物质可能会导致褐变。
例如，培养基中的钾离子过多可能导致组织和细胞质产生褐变。
4. 微生物或污染：组织培养广泛应用于微生物的细胞生长和变异。
然而，过量的细菌孳生或微生物污染可能会使组织发生内部腐败或污染。
5. 外部环境：在植物组织培养中，外部环境可能导致褐变的发生。
例如，高温、高湿度或光照强度过高等因素都可能对组织产生不利影响，导致组织褐变。
二、植物组织培养褐变的对策1. 准确按照操作方法进行：在分离和转移细胞或组织时，必须遵循操作规程。
任何超过细胞或组织能力的力量，都可能导致它们破裂和损伤，从而导致细胞褐变。
2. 控制培养物质：应对植物组织培养液内成分进行判断，控制氮、钾等营养物质的浓度，并定期植物异质接种和营养料补充来促进组织生长和分化。
3. 保护组织环境：采取洁净措施，保持培养环境无微生物侵入，减少细菌数量。
避免热、湿、光照强度过高的环境，加强组织生长环境的把控。
4. 装置保持：“装置”保持在可靠性、稳定性和实用性等方面总体考虑下选择合适的装置设备，减少操作过程带来的不良影响，通过装置控制，避免过度呼吸和氧化酶的活性增强等情况，道避免组织褐变。
植物组织培养褐变产生的因素及对策
植物组织培养褐变产生的因素及对策褐变在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。
褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。
褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。
本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。
1、褐变的危害褐变是指外植体在培养过程中，自身组织从表面培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。
褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。
很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。
在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。
对于外植体本身来讲，酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应，可诱导植保素或无物理屏障的形成，以防止微生物浸染组织。
但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活。
从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。
此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。
2、褐变产生的机理2.1 非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。
将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl 的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。
当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了2.2 酶促褐变目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的。
外植体褐变及解决措施
外植体褐变及解决措施外植体褐变及其解决措施褐变是植物组织培养过程中常见的问题。
它与真菌污染和玻璃化冷冻一起被称为植物组织培养的三大难题。
本文针对褐变问题，结合相关数据，对影响褐变的因素进行了综合分析，并针对这些因素提出了相应的解决方案。
褐变是指外植体在培养过程中，自身组织向表面培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。
一、褐变机理1非酶褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。
徐振彪等将生长正常的愈伤组织转移到含nacl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。
当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。
但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了。
2.酶促褐变目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的。
酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。
引起褐变的酶有多酚氧化酶(ppo)、过氧化物酶(pod)、苯丙氨酸解氨酶等。
从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和ppo的活性来看，表明ppo活性的高低是引起培养材料褐变的关键。
引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是ppo的底物。
在正常植物组织中，底物、氧和PPO同时存在而不褐变，因为在正常组织细胞中，多酚分布在液泡中，而PPO分布在各种质体或细胞质中。
这种区域分布使基质和PPO无法接触。
当细胞膜结构发生变化和破坏时，它为酶与PPO接触创造了条件。
在氧气存在下，苯酚被氧化成醌，并进行一系列脱水和聚合反应。
植物组织培养中褐变的发生机制与防治方法
植物组织培养中褐变的发生机制与防治方法刘悦（西北师范大学生命科学学院甘肃·兰州730070）摘要褐变是植物组织培养中的普遍存在的现象，已经成为影响组织培养成功的重要因素，并且已成为组织培养中的一大难题。
本文揭示了褐变的发生机制及控制机理、影响褐变的因素，并于此提出了防治褐变的措施，以期为解决褐变问题提供理论依据。
关键词植物组织褐变机制防治中图分类号：Q943.1文献标识码：A褐变在植物组织培养过程中普遍存在，国内学者普遍认为褐变能否得到有效控制是植物组织培养能否成功的关键所在，并且证明了褐变度与总酚含量以及PPO活性之间的关系因品种而异。
而国外学者Mayer和Harel则注意到正常果实组织中虽然存在有酚类物质和PPO，却并不发生褐变，指出果实中酚类物质和PPO在细胞中可能是区域化状态分布。
1褐变的发生机制关于褐变的发生机制，目前认为褐变分为两种：即酶促褐变和非酶促褐变。
但诸多研究认为引起褐变发生的主要是酶促褐变。
醌类化合物在酪氨酸酶的作用下与培养材料组织中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致代谢紊乱，生长受阻。
当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为底物创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，再进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而才引起褐变。
2影响褐变的因素不同的材料、环境条件、因素或操作手段都会严重影响褐变发生的程度,不同的褐变程度也跟实验结果、研究目的息息相关。
在外植物体材料的基因型与生理状态确定的情况下，外植物体的种类和大小、培养条件是影响褐变的主要因素。
2.1外植体的种类和大小一般认为，木本植物比草本植物的外植体在培养中更易发生褐变。
外植体小的材料，因为切口所占比例较大而较易发生褐变。
切口越大，酚类被氧化的面积就越大，褐变现象越严重。
2.2培养条件培养室的温度控制在15℃~20℃，可有效地防止褐变的发生。
高温一方面不利于伤口的愈合，另一方面会增强多酚氧化酶的生物活性，从而加速氧化过程，使植物材料的褐变更为严重。
植物组织培养过程中外植体褐变及处理方法
植物组织培养过程中外植体褐变及处理方法发布日期：2010-12-31 浏览次数：1231 褐变的原因：①植物品种研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。
由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。
因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。
②生理状态由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。
一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。
一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。
③培养基成分浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。
④培养条件不当如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。
2 褐变的防止措施为了提高组织培养的成苗率，必须对外植体的褐变现象加以控制。
可以采用以下措施防止、减轻褐变现象的发生。
①选择合适的外植体一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。
②合适的培养条件无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
③使用抗氧化剂在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。
另外使用0.1％～0.5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
④连续转移对容易褐变的材料可间隔12-24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-lOd后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。
植物组织培养中的褐变现象及解决途径
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生 物 技 术
谢丽霞等
植物组织培养中的褐变现象及解决途径
会在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体的蛋白质 聚合， 生长停顿， 最终导致死亡。
为： 黑暗、 漫射光、 短日照、 长日照。 因此， 在黑暗或 低光照培养一段时间能减轻褐变。培养温度、 光 照、培养时间等都对褐变有很大影响。卡特兰在
!
类化合物。 在完成植物体的细胞中， 当切割外植体 后， 切口附近细胞的分隔效应被打破， 酚类化合物 和多酚氧化物便流出，多酚氧化酶氧化酚类化合 物使之而成为褐色的醌类物质和水。醌类物质又
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 抽穗期早 # " ， 成熟期早 # "。 植物营养元素。水稻应用后， 秧苗素质好， 地下部 "， 根系发达， 白根多， 地上部不徒长， 秧苗健壮整齐， !"# 对产量的影响 处理 $ 与对照比较， 株 高 增 加 #%& ’(， 穗长 单株分蘖增加， 干物质积累多， 抗逆性强， 插秧后 增加 &%) ’(， 平方米穗数相同， 每穗实粒增加 $%* 返青快， 分蘖早； "能促进秧苗根系有机酸分泌增 个， 秕粒减少 &%* 个， 千粒重增加 &%+ ,， 增产 #+%+ 多， 在根系周围形成一个适合秧苗生长的小环境，
组织培养中褐变程度有很大差别。 一般来说， 多年 生木本植物一般比草本植物容易发生褐变，因为 木本植物的单宁或色素含量较高，而酚类的糖苷 化合物是木质素、 单宁和色素的和成前体， 所以木 本植物易褐变。
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与外植体生理状态有关 褐变随着年龄和组织木植化程度增加而加
强。 因此， 在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶 片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组 织 （或带少量叶原基） 接种更为理想； 如在欧洲栗 的培养中， 幼年型的外植体培养含醌类物质少， 而 用成年型材料培养时含醌类物质多；在卡得德亚 兰的培养中， 较短的新生茎致褐物质含量高， 而较 长的新生茎致褐物质含量低。不同生长季节取材 的培养成功率亦不同。 王续衍等 （"#$$ ） 对 %& 个苹 果品种进行茎尖培养时，发现冬春季取材褐变死 亡率低， 其他季节取材较重。 外植体大小也会影响 褐变， 例如， 用油棕幼嫩外植体 （胚 ） 培养较少褐 变， 而用高度分化的叶片接种后， 则褐变。受伤程 度大小也影响褐变。 为了减轻褐变， 切取外植体尽 可能减少伤口面积， 切口尽可能平整些。
植物组织培养中褐变机理和防治措施
植物组织培养中褐变机理和防治措施摘要：褐变现象是指组织培养诱导脱分化或再分化的过程中，外植体组织从表面向培养基释放褐色物质而使得培养基逐渐变成褐色，外植体随之褐变死亡的现象，褐变现象又称酚污染，在植物组织培养过程中经常出现。
对诱导外植体的脱分化和培再分化过程的影响非常大，甚至是影响某些植物组织培养成功与否的关键。
褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。
褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。
本文对褐变的影响因素和对策进行了研究。
关键词：组织培养，褐变，影响因素1. 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.1褐变类型及基因型物种及其基因型对褐化的影响。
植物组织培养过程中外植体的褐化主要由多酚氧化酶作用于酚类物质而引起的。
不同植物品种、同种植物的不同类型因为外植体材料的基因型不同，在组织培养中褐化发生的频率和程度都存在着较大的差异[4]。
由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，木本植物、单宁含量或色素含量高的植物酚类物质含量也很高，木质素、单宁或色素形成多，其组织培养就容易发生褐变。
因此，组织培养过程中，木本植物一般比草本植物易发生褐变。
目前报道发生褐变的植物中多数是木本植物[5]。
在木本植物中，核桃、板栗由于单宁含量很高，进行组织培养难度很大，不仅在接种后的初代培养期容易发生褐变，而且在形成愈伤组织以后也会因为褐变而引起死亡。
红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。
豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。
在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。
组培苗的褐化问题
组培苗的褐化问题很多种类的植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类物质氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，并会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结果是严重影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。
影响褐变的因素很多，植物的种类褐基因型、外植体的来源和生理状况以及培养基的成分都会不同程度的影响褐变的程度。
一般木本植物的外植体比较容易产生褐变现象，在成年树尤其严重。
培养基中含酚过高会导致褐变，含过高浓度的无机盐和肌醇也会加剧外植体的褐变。
6-苄氨基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）也有诱导褐化的作用。
强光和高温同样会促进褐化现象。
为了防止外植体的褐变，需要选取酚类化合物含量较低的实验材料，选择无机盐含量较低，不加肌醇的培养基，并在较弱的光线或黑暗的条件中进行培养。
在培养基中加入抗氧化剂是防止褐变的有效措施。
常用的抗氧化剂有抗坏血酸（VC）、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。
可用抗氧化剂溶液预先处理外植体，或者在抗氧化剂溶液中切割和剥离外植体。
必要时还可以将几种抗氧化剂结合使用。
也可以将抗氧化剂加入到培养基中。
另一种方法是在培养基中加入0.5～1％的活性炭，吸附对生长有抑制作用的褐色醌类物质。
应当注意的是：活性炭也能吸附培养基中的激素类物质，影响茎尖的分化和生长，因此在使用活性炭的场合，需要适当提高培养基中激素的浓度。
还有一种办法是不断地（每隔1～2d）将培养物转移到新鲜的培养基上，以摆脱老培养基中褐色物质的不利影响。
在使用液体培养基的情况下，这种方法相当有效。
1.在培养基中添加活性碳可以防止植物组织自身的酚类物质排泌和变褐老化。
对形态发生和器官形成有良好作用。
一般认为，活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子，可以减少一些有害物质的影响，但是具体吸附的选择性很差，温度低时吸附力增强，温度高是吸附力减弱，甚至会解吸附。
通常使用浓度为0.5-10g/L。
红掌组织培养过程中的外植体褐变研究
红掌组织培养过程中的外植体褐变研究摘要：在培养红掌组织的过程中，外植体容易产生褐变现象，从而对红掌组织的正常培养过程造成严重影响。
在本文中选取红掌“红粉佳人”作为选材产品，其外植?w选取健康植株幼嫩叶片，探究与分析在培养愈伤组织过程中出现褐变的现象。
采用不相同的抗坏血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、柠檬酸、叶酸等吸附剂、抗氧化剂、培养基硬度的防褐变现象进行观察与研究。
经研究发现，将0.2%聚乙烯吡咯烷酮PVP、4-D0.2mg/L、6-BA1.0mg/L均添加到5g/L硬度的琼脂MS培养基中，可在最大限度上对褐变现象进行有效控制，且提升愈伤诱导率。
关键词：外植体；褐变现象；红掌组织中图分类号：S682.14 文献标识码： A DOI编号：10.14025/ki.jlny.2018.10.030红掌又可称作火鹤花、红鹅掌、红掌植物界、安祖花，是天南星科多年生常绿草本植物[1]。
红掌的茎叶从基部萌出，呈绿色，全缘，卵心形或者是长圆状心形，茎节较短。
哥伦比亚、哥斯达黎加、厄瓜多尔等热带雨林地区盛产红掌，主要是因其适应潮湿温暖、不喜光的外部环境条件，也可附生在岩石上、树上或者是地上。
红掌具有较长花期，可常年开花，且放置于水瓶中生长期可长达30天左右，是一种具有极高观赏价值的高档盆栽[2]。
在通常情况下，红掌在繁殖过程中主要是以分株为主，必要时可采用扦插作为辅助繁殖，其繁殖速度相对较慢。
为了更好地满足与适应市场需求，其繁殖途径主要是以组织培养为主。
但在培养过程中容易出现外植体褐变现象，鉴于此，在本次研究中，探索出防褐变的最佳条件，旨在全面增长繁殖系数以及诱导率。
1资料与方法1.1一般资料选取红掌“红粉佳人”作为选材产品，其外植体选取健康植株幼嫩叶片，探究与分析在培养愈伤组织过程中出现褐变的现象。
采用不相同的抗坏血酸VC、聚乙烯吡咯烷酮PVP、活性炭AC、柠檬酸、叶酸等吸附剂、抗氧化剂、培养基硬度的防褐变现象进行观察与研究。
植物组织培养中的褐化现象和解决途径
褐化发生的形式及褐化发生机理 影响褐化的因素 防止褐化的途径 展望
பைடு நூலகம்
褐化发生的形式及褐化发生机理
褐化分为酶促褐化和非酶促褐化 1.非酶促褐化是由于细胞受胁迫条件或其它不利条件影响所造成的细胞死亡或自然发生的细胞死亡而造成的褐化其中不涉及到酚类物质的产生 2.酶促褐化是因为酚类物质的参与而引起的褐化现象
防止褐化的途径
一.选择适当的外植体 外植体组织的受伤害程度直接影响褐变的发生 Bonga认为外植体越小切面与体积的比率越大伤害及褐化的程度越大这在巨桉和卡德兰的组织培养中得到验证 Pruveni和Kipnis用椰子的完整胚、叶片作外植体进行培养也很少发生褐变 因此在切取外植体时应尽可能减少其伤口面积伤口剪切尽可能平整些切取外植体时还应考虑其粗度细的可切短些粗的可切长些
影响褐化的因素
1.外植体自身：包括外植体的生理状态、生长状态、外植体的遗传特性等 2.外植体所处的培养环境：包括培养基的成分及培养条件的影响
一.植物种类及基因型 1.不同物种之间褐化程度差异很大 2.同种植物的不同品种间也存在一定差异 橡胶树的花药培养中发现海垦2号花药的褐变较少因而愈伤组织化容易而有些品系花药容易褐化诱导困难； 银杏的众多品系中佛手品系比梅核品系诱导愈伤织困难 这些可能是由于外植体的基因型差异引起的
酶促褐化必须具备酶、底物和氧三个条件 1.酶 ：多酚氧化酶PPO、过氧化物酶POD、苯丙氨酸解氨酶PLA等 2.底物 ：酚类化合物 3.氧气
酚类物质的共同结构特点是都含有带羟基的苯环结构. 按其组成结构可分为: 1.苯基羧酸类包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等、 2.苯丙烷衍生物包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等、 3.黄烷衍生物包括花青素、黄酮、芸香苷等三大类
植物组织培养中的褐变现象与防止方法
植物组织培养中的褐变现象与防止方法植物组织培养中出现褐变现象是一种常见的问题，褐变通常是因为植物组织培养过程中遭受到内部或外部压力所致。
褐变不仅会导致组织的死亡，也会影响到培养物的生长和发育。
因此，了解褐变的原因并采取相应的防止方法非常重要。
褐变现象发生的原因可以归纳为以下几个方面：1.感染：细菌、真菌和病毒感染是导致褐变的常见原因。
感染会导致组织坏死并产生褐色产物，从而导致组织培养失败。
解决方法：进行无菌操作，确保培养环境的无菌状态，并加强培养物的保护。
使用抗菌剂、消毒剂和抗生素等来抑制病菌的生长和传播。
2.氧化：氧化应激是导致组织褐变的常见原因之一、当细胞受到氧化应激时，产生大量的活性氧自由基，进而导致细胞内物质的氧化和组织褐变。
解决方法：在培养过程中尽量减少暴露在空气中的时间，并加入适量的抗氧化剂，如抗坏血酸、多酚等，来减少氧化损伤。
3.脱水：组织细胞在培养过程中由于脱水导致的细胞膜破裂，会释放出酶和多酚等有害物质，从而导致组织褐变。
解决方法：在组织切割后尽快进行培养，避免组织脱水。
可以使用无菌的生理盐水或培养基进行预处理，来保持组织的水分。
4.存储条件不适宜：组织在培养过程中需要适当的温度、湿度和光照等条件来维持其正常的生理活性。
如果存储条件不适宜，会导致组织的死亡和褐变的产生。
解决方法：在培养室中提供适宜的温度、湿度和光照条件，并定期检查和调节培养环境的参数，以确保组织的正常生长和发育。
总之，在植物组织培养中防止褐变现象的发生，需要保持无菌环境、抑制病菌感染、减少氧化应激、防止组织脱水和提供适宜的存储条件。
通过这些措施，可以有效减少组织的褐变现象，提高培养物的生长和发育效果。
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化时间、全部褐化时间及外植体的情况。每种处理 20 个, 3 次重复。 1. 3 培养基中添加抗氧化剂对外植体褐化的影响
以 M S、1/ 2M S、1/ 4M S 为基本培养基, 在每种 培养基中分 别添 加 A ( 亚 硫酸钠 ) 、B ( 柠 檬酸) 、C ( Vc) 3 种抗氧化剂, 每种培养基 再分别加入 6- BA ( 1. 0, 1. 5, 2. 0 mg / L ) 和 2, 4- D0. 4 mg / L ; 用已筛选 出的最佳消毒剂和抗氧化剂处理方式处理外植体, 然后每种处理接种 30 个外植体, 观察记录外植体褐 化时间及情况。 1. 4 培养基 pH 值对外植体褐化的影响
1 材料与方法
1. 1 材料 红掌盆花品种亚利桑那( Arizona) 。
1. 2 消毒方法对外植体褐化的影响 将剪切好的红掌嫩茎段和嫩叶片在 3 种抗氧化
剂[ 3] : A ( 亚硫酸钠) 、B( 柠檬酸) 、C( V c) 2% 水溶液 中浸泡 5m in, 取出无菌水冲洗 3 次, 然后在 75% 酒 精中速浸 10 s, 取出用无菌水冲洗 5 次, 接着分别放 入 0. 1% 升汞溶液、10% 过氧化氢溶液、20% 次氯酸 钠溶液 3 种消毒剂中浸泡 10 min, 取出用无菌水再 冲洗 5 次, 摊晾在无菌纸上, 观察记录外植体开始褐
贵州农业科学 2010, 38( 2) : 160~ 162 Guizho u A g ricultur al Sciences
[ 文章编号] 1001- 3601( 2010) 02- 0114- 0160- 03
红掌组培过程中外植体褐化问题的解决措施
祁 翔, 刘 燕, 王 莹, 王济红*
( 贵州省生物研究所, 贵州 贵阳 550009)
剂 A 处理的次之; 抗氧化剂 B 较差。 2. 2 不同培养基和抗氧化剂对红掌褐化的影响
从表 2、表 3 可知, 在 M S 培养基中, 叶片接种
B、C 3 种抗氧化剂处理再用升汞处理的试验中, 用 1d 后大部分褐化, 30d 后全部死亡, 茎段接种 1d 后
表 1 不同抗氧化剂和消 毒剂对红掌外植体褐化的影响
87 2 12 大部分褐 化死亡
44 97 剪口褐化 中间绿色
68
96 大部分褐 化死亡
0 0 全部褐 化死亡
0 17 全部褐 化死亡
0
0 全部褐 化死亡
0 5 大部分褐 化死亡
0 19 大部分褐 化死亡
0
0 大部分褐 化死亡
注:/ 初0 为外植体开始褐化时间, 单位为 min;/ 全0 为外植体全部褐化时间, 单位为 m in; / 状况0 为外植体全部褐化后的情况。
组培繁殖, 已有很多相关报道, 但是, 由于商业利益 的原因, 许多已报道的技术文献均不能达到较好的 重复[ 2] 。笔者通过重复许多已报道的红掌组织培养 技术, 发现在组织培养过程中红掌外植体容易褐化, 从而降低组织培养的成功率。外植体初步接种能否 降低褐化的问题是影响组培成功与否的第一个关键 问题。目前该方面的报道甚少, 因而有必要就解决 外植体褐化的技术进行系统研究。
以 1/ 2M S 培养基为 基本培养基, 添加 激素为 6- BA 1. 5 mg / L + 2- 4- D 0. 4 mg / L , 调节培养基 pH 值分别为 4. 8、5. 2、5. 6、6. 0、6. 4, 每种处理分别接 种 30 个外植体, 观察记录外植体褐化时间及情况。 1. 5 培养条件
如上所有培养基均加入蔗糖 20g / L , 琼脂 10 g/ L , 活性碳 0. 2g / L , pH 值若不注明, 均为 5. 8; 光照 时间为 14 h/ d, 光照强度 1 500~ 2000 lx, 温度为( 25 ? 2) e 。
2 结果与分析
2. 1 不同抗氧化剂、消毒剂处理后对红掌叶片、茎 段外植体褐化的影响
接种数 Ex plants
MS 褐化数
Bro wned
死亡数 F atality
培养基 M edia 1/ 2MS
接种数 褐化数 死亡数
Ex plants Bro wned F atality
1/ 4MS 接种数 褐化数
Ex plants Bro wned
A
BA 1. 0
30
5
30
BA 1. 5
30
6
30
BA 2. 0
30
3
30
30
2
29
30
1
28
30
0
30
30
3
30
2
30
0
B
BA 1. 0
30
4
25
BA 1. 5
30
2
23
BA 2. 0
30
1
26
30
表 3 不同培养基、抗氧化剂和激素对茎段褐化 的影响
T able 3 Effect of different culture media, ant-i o xidants, and ho rmone on stem brow ning
抗氧化剂 激素配比 Ho rmone
A nt-i o xidant pr opor tion
A
BA 1. 0
30
29
30
BA 1. 5
30
30
30
30
25
29
30
26
28
30
23
30
30
22
30
BA 2. 0
30
30
30
B
BA 1. 0
30
29
30
BA 1. 5
30
30
30
30
22
30
30
2
4
30
3
5
30
19
27
30
2
6
30
3
5
BA 2. 0
30
29
30
C
BA 1. 0
30
30
30
BA 1. 5
表 2 不同培养基、抗氧化剂和激素对叶片褐化 的影响
T able 2 Effect of different culture media, ant-i o x idants, and ho rmo ne on leaf br ow ning
抗氧化剂 激素配比 A nt-i o xidant Ho rmone
第2期
祁 翔 等 红掌组培过程中外植体褐化问题的解决措施
# 161 #
( 柠檬酸) 、C( Vc) 3 种抗氧化剂处理后, 再用不同的 常规消毒剂按消毒程序处理, 只有用升汞消毒剂处
抗氧化剂 C 处理的效果最好, 外植 体褐化较慢, 完 全褐化时间长达 4 h 左右, 外植体活力较好; 抗氧化
理的外植体在全部褐化后, 仍有大部分组织保存活 力, 过氧化氢和次氯酸 钠消毒后, 外植体大部 分死 亡, 所以适宜红掌的消毒剂为升汞; 在所有先用 A、
( Guizhou Institute of Biology , Guiy ang, Guizhou 550009, China)
Abstract: Dif f erent disinf ect ion m et hods w ere applied t o ex plant s, improvement and adjust ment of cult ure m edia, and culture conditions select ion w ere studied in t his paper to solv e t he br ow ning o f explants w hich af f ect ed t he survive o f A nt hur ium andr eanum in tissue cult ure. Result s show ed t hat pretr eat ed by ant-i ox idant bef ore t ransplant ing and cor respo nding ox idants added in cult ur e media could reduce the bro w ning, sequent ially t he reproduct ion r at e o f ex plant s could be enhanced.
pr opor tion
接种数 Ex plants
MS 褐化数
Bro wned
死亡数 F atality
培养基 M edia 1/ 2MS
接种数 褐化数 死亡数
Ex plants Bro wned F atality
1/ 4MS 接种数 褐化数
Ex plants Bro wned
死亡数 F atality
Key words: A nt hur ium andr aeanum ; explant s; brow ning ; ant-i ox idant
红掌( A nthur i um andr aeanum L inden) 又名安 祖花、花烛, 是 天南星科花烛属 多年生常绿草 本花 卉, 是世界热销切花、盆花名优花卉之一[ 1] 。从 70 年代开始引入我国, 到 90 年代已有许多科研院所对 其进行了详细的研究[ 1-2] 。目前红掌的繁殖主要是
T able 1 Effect o f different ant-i ox idants and disinfectant s to explants bro wning o f A nthur ium andr aeanum
抗氧化剂 褐化时间 A nt-i o xidant T ime
升汞 Hg Cl2