甘油激酶法测定葡萄酒中甘油的含量

甘油激酶法测定葡萄酒中甘油的含量
中国食品发酵工业研究院；赛默飞世尔科技（中国）有限公司
摘要：本实验使用Thermo Scientific Arena全自动工业生化分析仪，采用甘油的酶法分析试剂盒，建立了甘油激酶法快速检测葡萄酒中甘油含量的分析方法。

实验表明甘油含量在0.2～10.00g/L浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9998；加标回收率(n=3)在101.09%～104.49%之间；精密度和重复性(n=8)的RSD%分别为1.03%和1.34%。

该法具有无需样品前处理、特异性好、灵敏度高、测定速度快等优点，适用于葡萄酒企业对苹果酸-乳酸发酵过程控制和葡萄酒产品的质量检测。

关键词：甘油；葡萄酒；甘油激酶；Arena全自动分立式分析技术
Glycerokinase Determination of Glycerol in Wine
China National Research Institute of Food & Fermentation Industries, 100027, Beijing
Thermo Fisher Scientific (China) Inc., 100007, Beijing
Abstract:Applying Thermo Scientific Arena Automated Discrete Analyzer, using Glycerol enzymatic kits, a method was developed for rapidly analyzing the concentration of Glycerol in wine. A suitable linear relationship was obtained between the concentrations of Glycerol (0.200～15.00g/L) and the correlation coefficient was 0.9998; the Recovery ratio (n=3) were between 101.09%～104.49%;the RSD% of precision and repeatability (n=8) were 1.03% and 1.34% respectively. This method is simple, specific, sensitive, rapid, and good for determination of Glycerol in wines, suitable for monitoring samples during MLF brewing process and quality control of the finished wine in winery.
Keywords: Glycerol, Wine, Glycerokinase (GK), Arena Automated Discrete Technology
前言
甘油又名丙三醇，是一种无色、无臭、味甘的粘稠液体。

甘油是一种重要的食品添加剂，运动食品和代乳品中通常使用的甜味剂和保湿剂。

甘油也是一些化妆品的重要成分，能够使皮肤保持柔软，富有弹性，保湿防干燥，防止皮肤冻伤。

甘油是碳水化合物发酵主要副产品，虽然它难挥发，对葡萄酒的香气没有直接贡献，但对葡萄酒的口感和味觉有很大贡献[1~4]，正常发酵产品中的甘油乙醇比值是固定的，可以通过该比值可判断葡萄酒的真伪。

甘油/乙醇比值太高说明这种葡萄酒添加了甘油；甘油/乙醇比值太低可能是添加了乙醇或甘油被不良微生物分解[5]。

甘油是干型和半干型葡萄酒的主要组成分之一，决定着葡萄酒质量。

甘油是葡萄酒酵母正常发酵的副产物，主要在葡萄汁发酵初期产生。

据报道，通常葡萄酒中甘油含量为3~20g/L，就其含量而言，仅次于乙醇。

目前在葡萄酒行业测定甘油的方法主要是高效液相色谱法[6]，而且甘油含量作为判断酿造葡萄酒质量的指标越来越受到行业内的重视。

酶法分析具有操作简单、灵敏、快速、准确、可靠的优点，而且更重要的是容易形成自动化，在国外葡萄酒和果汁生产企业已经被广泛采用，并且纳入了许多国际标准和行业法规中[7]。

而在国内，一直缺乏一种能够快速、准确应用酶法试剂盒的检测工具，目前赛默飞世尔科技有限公司提供的Arena全自动工业生化分析仪解决了这一难题，可以实现葡萄酒和果汁样品中多个指标的酶法分析和快速检测，有望改变葡萄酒企业的工作模式。

本文拟采用Arena全自动工业生化分析仪的甘油激酶法对成品酒中甘油含量的快速检测方法进行研究，该技术适用于葡萄酒和果汁企业的生产过程控制和产品质量检验。

1．材料与方法
1.1 主要仪器
Arena 20XT全自动工业生化分析仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；
1.2 试剂与耗材
甘油试剂盒、甘油标准品（0.206g/L），赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供；
干红、干白葡萄酒样品，葡萄酒公司提供；实验用水为高纯水。

1.3 检测原理
甘油激酶（GK）专一性地催化甘油转化为L-甘油-3-磷酸，同时消耗一分子ATP并转化为ADP形式，见反应[1]；随后在ADP依赖型己糖激酶（ADP-HK）的催化作用下，等摩尔数的葡萄糖被转化为D-葡萄糖-6-磷酸，见反应[2]；生成的D-葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6P-DH）的催化下转化成D-吡喃葡萄糖酸-δ-内酯-6-磷酸，同时伴随着等摩尔数的NAD+转变成NADH，见反应[3]。

Arena分析仪通过分光光度法测定NADH在340nm波长下的吸光度增加值，即可定量计算出样品中甘油的浓度。

甘油 + ATP <甘油激酶> L-甘油-3-磷酸 + ADP[1]
D-葡萄糖 + ADP ADP依赖型己糖激酶> D-葡萄糖-6-磷酸+ AMP [2]
D-葡萄糖-6-磷酸 + NAD+ 葡萄糖-6-磷酸激酶>D-吡喃葡萄糖酸-δ-内酯-6-磷酸+ NADH + H+ [3]
该反应过程中，甘油激酶只对甘油起作用，专一性好，在同一反应体系中迅速实现多种物质之间的酶催化的生物转化，效率高，物质的量关系准确，所以最终检测获得的吸光度值可以等量地换算为甘油的含量。

此方法也可用于葡萄酒和果汁原料中天然成分的检测，实验过程排除了人为误差的影响，重复性好，准确度高，对于产品生产过程控制和终产品质量检验具有重要意义。

1.4 实验方法
1.4.1定标
取1mL超纯水、1mL含甘油0.206g/L的标准液置于样品架上，按仪器设定参数定标。

定标类型：线性；重复时间：1天；定标各点重测次数：2次；手动接受；定标品类型：Separate；
1.4.2检测流程
试剂R1：100µL；样品量：5µL；孵育时间1：120s；读取空白；试剂R2：25µL；孵育时间2：420s；检测波长：340nm；终点法读数。

1.4.3样品测定
取待测样品各约1mL，置于样品架各个样品位上，按照仪器的使用规程和参数设定进行检测，自动计算结果。

2．结果与讨论
2.1 定标
用高纯水和甘油含量为0.206g/L的标准液对仪器进行定标，定标结果如下：因子（Factor）= 0.410，偏差(Bias)= 0.210，相关系数(R2)=0.9999。

2.2 标准曲线和检出限
配制6个浓度梯度的甘油标准溶液（0.200～15.000g/L），按照Arena20XT 仪器设定的参数进行测定，以测定响应值（y）对浓度（x）作标准曲线，所得线性回归方程为：y=1.014x + 0.066，相关系数R2=0.9991，甘油在0.200～15.000g/L浓度范围内与仪器响应值线性关系良好，可用于定量检测葡萄酒样品中甘油的含量。

把空白对照样品用以上检测方法连续测定20次，根据AOAC推荐的检出限和定量限计算公式[3]，计算得出仪器对甘油的检出限和定量限分别为0.041g/L和0.186g/L。

A L= A b + KS b [3]
式中A L（Average of low lever）是分析试样在检出限水平时测得的分析信号的平均值，即最小检测信号值（响应值）；A b（Average of blank）和S b（SD of blank）分别为在测定试样相同条件下，对空白试样进行足够多次（比如20次）测量所得的空白信号（噪声）的平均值和测定的标准偏差；K是由置信水平决定的系数，IUPAC推荐K=3，在误差正态分布条件下，其置信度为99.7%。

A L值所对应的被测元素的量或浓度即为
最小检出量Q L和最小检出浓度C L，即检出限(Limit of Detection，LOD)；K=10时计算的A L值为定量限(Limit of Quantitation，LOQ)。

2.3 加标回收率
分别向干红葡萄酒和干白葡萄酒中加入高、中、低三个不同浓度梯度的甘油标准溶液，按照Arena仪器设定参数测定并计算回收率，干红回收率在101.09%～101.69%之间，干白回收率在102.10%～104.49%之间，见表1。

表明该方法检出效果好，测定结果稳定、可靠，能够满足对葡萄酒中甘油含量的定量检测。

表1 甘油激酶法测定葡萄酒中甘油的加标回收率(n=3)
Table 1 Recovery test of in wine by Glycerokinase (n=3)
名称原始浓度(g/L) 加入浓度(g/L) 测定浓度(g/L) 平均回收率%
干红葡萄酒3.552 1.980
2.001±0.237
101.09
3.552 3.959
4.012±0.071
101.34 3.552 5.822
5.920±0.148
101.69
干白葡萄酒3,597 1.568
1.438±0.117
102.91 3,597 3.136
2.972±0.027
102.10 3,597 4.704
4.624±0.009
104.49
2.4 精密度、重复性测定
分别选择干红葡萄酒和干白葡萄酒做精密度、重复性的实验。

对同一样品按本方法进行10次重复测定，计算对干红葡萄酒和干白葡萄酒样品的精密度检测结果（RSD%）分别为0.98%和1.12%；对同一样品取10份按本方法分别测定，计算对干红葡萄酒和干白葡萄酒的重复性检测结果（RSD%）分别为1.44%和2.36%；结果分别见表2和表3。

表2 甘油激酶法对葡萄酒中甘油含量的精密度测定结果（n=10）
Table 2 Precision test of Glycerol in wine by Glycerokinase (n=10)
测定次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
平均值RSD%
甘油
含量（g/L）干红7.920 8.000 8.0168.0767.9077.8427.8818.02979537.868 7.949 0.982干白 4.597 4.608 4.683 4.713 4.640 4.726 4.574 4.709 4.654 4.653 4.656 1.120
表3 甘油激酶法对葡萄酒中甘油含量的重复性测定结果（n=10）
Table 3 Repeatability test of Glycerol in wine by Glycerokinase (n=10)
测定次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
平均值RSD%
甘油
含量（g/L）干红 3.566 3.561 3.580 3.631 3.598 3.563 3.557 3.505 3.509 3.451 3.552 1.44 干白 2.402 2.459 2.477 2.488 2.476 2.411 2.384 2.395 2.495 2.318 2.431 2.36
2.5 样品测定
分别对19种干红、干白葡萄酒样品按照同样方法进行测定，甘油含量的结果见下表：
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 葡萄酒干红1 干红2 干红3 干红4 干红5 干红6 干红7 干红8 干红9 干红10
甘油（g/L） 7.920 6.899 9.432 6.872 6.13 4.47 7.31 7.455 7.806 7.18 编号11 12 13 14 15 16 17 18 19
葡萄酒干红11 干红12 干红13 干红14干红15 干白1 干白2 干白3 干白4
甘油（g/L） 6.440 6.511 7.962 4.54 7.938 3.934 4.72 4.368 4.597
3. 结论
本文建立了使用全自动工业生化分析仪，采用甘油酶法分析试剂盒测定葡萄酒中甘油含量的方法，该方法的加标回收率介于101.09%～104.49%之间，精密度和重复性分别是1.03%和1.34%，检测结果精确度高。

此外，该方法使用Arena全自动工业生化分析仪，具有快速、方便、经济、可靠等优点，实现了检测过程的自动化，能够满足酒类企业对产品的快速检验和葡萄酒生产过程质量控制的需求。

参考文献
[1] Mihaela Niculescu, Rasa Mieliauskiene, Valdas Laurinavicius, Elisabeth Csoregi,Food Chemistry 82
(2003) 481–489
[2] Ribe´reau-Gayon P, Dubourdieu D, Done`che B, Lonvaud A.Handbook of enology, volume 1,
the microbiology of wine andvinifications. West Sussex, England: Wiley, 2000:60.
[3] Noble AC, Bursick GF. The contribution of glycerol to perceivedviscosity and sweetness in white
wine. Am J Enol Viticult1984;35:110-3
[4] Ribe´reau-Gayon P, Glories Y, Maujean A, Dubourdieu D.Handbook of enology, volume 2,
the chemistry of wine, stabiliza-tion and treatments. West Sussex, England: Wiley, 2000:46
[5] E. Mataix, M.D. Luque de Castro, Talanta 51 (2000) 489–496
[6] 王剑锋，修志龙，范圣. 甘油转化生产丙二醇发酵液中甘油含量的测定[J]. 工业微生物，2001，31 (2) ：33 -35.
[7] OIV. International methods of analysis for wine, (Resolution Oeno 8/98) edition 2006, Volume1.
[8] 张诗玲，徐瑞敏. 红葡萄酒苹果酸-乳酸发酵控制与检验方法.酿酒.2007,34(6):84-85.
[9] 张永生, 高辉, 王艳萍.克拉维酸发酵液中碳源—甘油含量的比色法测定.天津科技大学学报，2006,21（1）：15-17。