实验二 凝集、沉淀反应

相应抗体
沉淀线或沉淀环
琼脂扩散试验：
琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，高温时溶于 水，冷却后凝固，形成凝胶，呈多孔结构，充满水 分，允许各种抗原抗体分子自由扩散。二者于比例 适当处相遇，发生沉淀，形成可见的沉淀带。
分类：
单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 —— 定量实验
双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散 —— 定性实验
（一）单向琼脂扩散试验 （示教）
原理:
适宜浓度的抗体预先在琼脂中混匀后制成琼脂板，以 适当距离打孔，将可溶性抗原至孔中，抗原向周围扩散，与 琼脂中抗体相遇，抗原与抗体比例适宜时，出现沉淀。沉淀 环的直径与孔中抗原浓度呈正相关，可根据沉淀环直径大小 从预先绘制成的标准曲线查出待测标本中抗原含量。
本试验方法简单，容易观察结果，可测定抗原的灵敏度 约为10～20μg／ml.
应用:
检测 AFP 、HBsAg, 协助疾病诊断.
双向琼脂扩散法测血清中AFP
甲胎蛋白（AFP）：
是一种在胚胎期由肝细胞和卵黄囊合成的α球蛋白， 存在于胎儿血清中，出生后血清中AFP几乎消失。正常 成人血清中仅含极微量的AFP，经典的免疫学方法检测 不出。
当肝细胞发生癌变时，AFP含量增高，测血清中AFP， 可协助诊断原发性肝癌。
2、3两孔（待测血清）如与中心孔之间也出现了沉淀线，且一端与 相邻的阳性对照血清形成的沉淀线相吻合，则该待测血清为阳性。
如待测血清与中心孔出现了沉淀线，但与阳性对照血清的沉淀线相 交叉，不判为阳性。 如待测血清24h内与中心孔间无沉淀线则为阴性。
双向扩散法测血清中AFP注意事项
1、琼脂板一定平整、光滑 (无气泡)，琼脂不可过厚； 2、打孔不要划破边缘； 3、加样要加满而不溢出为止； 4、合理分配吸管，Ag、Ab吸管不能混淆。
材料：
待测血清、 AFP阳性血清、AFP诊断血清（兔抗人AFP ）、 生理盐水、琼脂板、打孔器、针头、毛细滴管、酒精灯。
双向扩散法测血清中AFP操作步骤
1、制备琼脂板：
1%盐水琼脂加热溶化，取5ml均匀铺与载玻片上。
2、打孔：
琼脂凝固后，用打孔器打孔成梅花型，针头取出孔中琼脂。
3、封底：
用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。
4、加样：
中间孔加抗AFP抗体，1、4孔加AFP阳性对照，2、3孔加待检血清，5、6孔加 生理盐水。
5、反应：
于湿盒，37C 24h。
1
6
2Biblioteka Baidu
5
3
4
抗AFP抗体
A1g
6
2 Ag?
Ab
5
3 Ag?
4
Ag
双向扩散法测血清中AFP实验结果
1
6
2
5
3
4
1
6
2
5
3
4
1、4两孔（阳性对照孔）与中心孔之间应出现清晰的乳白色沉淀线， 5、6（阴性对照孔）两孔与中心孔之间无沉淀线。
寒杆菌诊断血清、生理盐水； ❖ 用接种环取待测菌液，分别涂布于生理盐水和伤寒血
清中，混匀； ❖ 轻轻摇动玻片，1~2分钟后观察结果。
生理盐水 ＋
待测菌液
阴性
伤寒血清 ＋
待测菌液
？
直接凝集反应玻片法--菌种鉴定
结果及判断
❖ 盐水侧无凝集颗粒； ❖ 血清侧出现肉眼可见的凝集块为阳性，仍为均匀一致乳浊
液者为阴性。
谢谢
实验材料
伤寒杆菌诊断血清、伤寒杆菌菌液、生理盐水、 载玻片、接种环、记号笔、酒精灯；琼脂板、 打孔器、针头、毛细滴管、待测血清、 AFP阳 性血清、AFP诊断血清（兔抗人AFP ）等。
实验内容
1.直接凝集反应：玻片法（操作） 2.沉淀反应： （1）单向琼脂扩散试验（示教） （2）双向琼脂扩散试验（操作）
注意事项
1、接种环在伤寒菌液取菌前后均需严格灭菌，以免出现假阳 性。 2、注意涂菌时，先涂生理盐水侧，以免污染血清产生错误结 果。 3、摇动玻片时不要把两凹内液体混在一起。
二、沉淀反应:
➢ 经典抗原抗体反应的一种。
➢
+
可溶性抗原
➢ 分类:
✓ 琼脂扩散 ✓ 环状沉淀反应 ✓ 絮状沉淀反应 ✓ 免疫电泳
凝集反应与沉淀反应的比较
抗原性质 反应时间 反应产物
凝集反应
沉淀反应
颗粒性或可溶性抗原致 可溶性 敏颗粒
几分钟
数小时至数天
凝集块
沉淀物
思考题
❖ 1、凝集反应的原理及直接凝集反应玻片法的 用途是什么？
❖ 2、沉淀反应的原理是什么？
作业
1 写出实验报告 2 分析凝集反应的结果和意义 3 绘出双向琼脂扩散试验结果图
常见抗原抗体反应的种类
抗原抗体反应又称血清学反应，主要有：
1、凝集反应 2、沉淀反应 3、补体参与反应 4、中和反应 5、免疫标记技术
一、凝集反应
(一)概念
颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应抗体结合，在 一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。
颗粒性Ag 又称凝集原 相应Ab 又称凝集素
直接凝集反应玻片法--菌种鉴定
实验目的
1.熟悉凝集反应、沉淀反应的概念。 2.了解单向琼脂扩散实验的原理、方法及应用。 3.掌握直接凝集反应玻片法的原理、方法及其
用途。 4.掌握双向琼脂扩散实验的原理、方法、结果
判断。
实验原理
1.直接凝集反应：颗粒性抗原与相应抗体结合后所呈 现的肉眼可见的凝集现象。 。
2.沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在适当条件下结 合而出现的沉淀现象。
应用:
人血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量检测。
单向琼脂扩散实验:
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
1:80
1:40 1:20
1:10
未知
沉淀环直径平方
抗原浓度
（二）双向琼脂扩散试验 （操作）
原理:
将可溶性抗原与相应抗体两种溶液置于琼脂糖凝胶的不 同位置，使两者在凝胶中各自向四周扩散,抗原与抗体相遇并 在比例合适处形成可见的乳白色沉淀线。
原理 玻片凝集试验是一种快速简便的检测方法，即抗
原抗体的反应在玻片上进行，是一种定性的试验。用 已知抗体检测未知抗原。
本试验用已知的伤寒杆菌标准诊断血清鉴定未知 细菌。
材料
伤寒杆菌诊断血清、伤寒杆菌菌液、生理盐水、 载玻片、接种环、蜡笔、酒精灯等。
直接凝集反应玻片法--菌种鉴定
操作步骤
❖ 取洁净玻片1张，用蜡笔划分2等份，如下图所示 ； ❖ 无菌操作，用接种环分别于一、二格内各加2～3环伤