高效液相色谱柱的选择
Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择
Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择2016-04-25 Bruce Lee生产高效液相色谱柱的厂家有很多，如Waters，Agilent，Phenomenex，Shimadzu，Thermo等，每家供应商又生产多个系列，导致市场上的液相色谱柱的可选择性极强。
目前实验室以及公司，企业使用最多的是Waters以及Agilent所生产的RP液相色谱柱。
Waters主要有Symmetry，Sunfire，XTerra，XBridge，XSelect，CORTECS以及Atlantis系列等，其详细分类以及键合相如下。
Figure 1 Waters Symmetry column familyFigure 2 Waters Sunfire column familySymmetry与Sunfire系列色谱柱使用高纯度硅胶（B型）作为固定相基质，摒除金属离子杂质对固定相Si-O键的促进水解作用，此外由于金属离子含量特别低，在对其表面键合选择性烃基或内嵌极性官能团烃基时，可通过配体添加量控制硅胶表面键合相的多少，因此其最大特点在于批次之间的重现性。
两个系列均采用封端技术，Sunfire C8与C18表面载碳量分别为12%和16%；SymmetryC8与C18载碳量均为12%，因此两个系列的C8色谱柱对于分析物的保留能力上没有本质的区别，而Sunfire C18色谱柱则相比Symmetry C18色谱柱，对于非极性比较大的分析物具有更强一些的保留能力，当然对于有机相的最低比例也相对比较高一些。
Symmetry C8 Prep与C18 Prep色谱柱的填料粒径为7 um，其设计用途为制备；Symmetry300 C18（孔径300埃，载碳量8.5%）与Symmetry300 C4（孔径300埃，载碳量2.8%）则是为生物大分子多肽以及蛋白质的分离，分析而设计。
Symmetry Shield RP 18内嵌极性官能团色谱柱，由于在靠近硅胶表面的极性官能团的存在，增加了硅胶表面的水分子浓度，改善了与水之间的浸润状况;因此可以允许使用极高水相作为分离，分析条件，而不会出现孔隙内去湿现象，对于分析碱性等大极性分析物而言，减少其保留能力，改善峰形，具有很高的方法重现性。
液相色谱柱几个参数的定义
液相色谱柱几个参数的定义液相色谱（Liquid Chromatography，LC）是一种将液体作为流动相进行分离、净化、分析和鉴定样品中化学成分的方法。
液相色谱柱是液相色谱中的核心部件，它通过填充不同类型和性质的固体填料，使样品溶液在流动相作用下发生分离。
液相色谱柱的参数对于分离效果、分离速度和分离选择性等方面都产生重要影响，下面将介绍几个重要的液相色谱柱参数的定义。
1. 柱型（Column Type）：柱型是指液相色谱柱填料的物理形态，包括管状柱、开管状柱、管束柱等。
不同类型的柱具有不同的优缺点，如管状柱具有高分离效果和分辨率，但样品容量较小；开管状柱则具有较大的样品容量，适合分离复杂样品。
2. 柱长度（Column Length）：柱长度是指填充物所占据的柱体长度，通常用毫米（mm）表示。
柱长的选择与实验要求有关，一般柱长越长，分离效果越好，但分离时间也相应增加。
柱长的选择还取决于仪器的型号和分析要求。
3. 内径（Inner Diameter）：内径是液相色谱柱内部流通通道的直径，通常用毫米（mm）表示。
较小直径的柱内液流速度快，分离效果好，但柱内压力较高，适用于高效液相色谱；较大直径的柱则适用于制备液相色谱。
4. 填料（Stationary Phase）：填料是液相色谱柱中的固体物质，用于将样品分离。
填料可以是无机或有机颗粒，也可以是化学修饰后的硅胶、高效液相填料等。
填料的选择取决于样品的性质和分析要求，不同填料具有不同的静相亲水性、反相亲水性等物化特性。
5. 粒径（Particle Size）：粒径是填料表面质量的衡量指标，即填料颗粒的直径。
粒径直接影响分离效果和柱压，通常用微米（μm）表示。
较小的粒径有更大的表面积，提供更好的分离效果，但柱压也相应增加，适用于高效液相色谱；较大的粒径则用于制备液相色谱。
6. 球形度（Sphericity）：球形度是填料颗粒外形的一个参数，它形容填料颗粒的形态规则程度，通常用于判断填料的质量和性能。
高效液相色谱法的标准曲线法流程
高效液相色谱法的标准曲线法流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的分析技术，用于测定样品中化合物的浓度。
液相色谱柱的选择与使用
液相色谱柱的选择与使用
目录 一、液相色谱柱的选择 1、 分离模式的选择 2、 C-18柱的性能影响因素 3、 保留值与pH的关系 二、液相色谱柱的安装 1 、液相色谱柱的结构 2、 色谱柱的安装 三、液相色谱柱的使用 1 、样品的前处理 2 、流动相的配制 3、 色谱柱的平衡 4、 流动相流速的选择 四、 分析条件调整的影响 五、液相色谱柱的维护
• 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 —甚至很小的 0.05–0.25 个pH变化单位.
保留值与pH的关系
pH变化： 0.2个pH(7.0~7.2) 保留时间改变： 1.2分钟 (13.6~14.8分钟)
保留时间随pH 改变不明显
保留时间随pH改变 不明显(酸性环境中)
保留时间
保留值与pH的关系
•碳覆盖率 •封端
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
C-18柱的性能影响因素：色谱柱物理性质
硅胶纯度 • 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸 • 填料床的长度和内径
颗粒形状 • 球型或不规则型
粒径 • 平均颗粒直径, 通常3-10µm
表面积 • 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示
封端 • 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键
合后封闭起来
C-18柱的性能影响因素：键合类型
CH3
键合类型对色谱分离的影响 ： O Si
单齿键合：
CH3
OSi
CH3
提高传质速率, 加快色谱柱平衡
O Si CH3
CH3
OSi
CH 3
双齿键合：
O Si
增加色谱柱稳定性, 增加色谱柱的载
安捷伦的色谱柱的介绍及选择
安捷伦的色谱柱的介绍及选择安捷伦（Agilent）是一家全球领先的科学仪器和化学分析解决方案提供商，其色谱柱产品在色谱分析领域具有广泛的应用和卓越的性能。
在选择安捷伦色谱柱时，需要考虑样品类型、分析目标、分析条件和仪器兼容性等因素。
本文将详细介绍安捷伦色谱柱的特点、类型和选择要点，以帮助读者更好地了解和选择适合自己实验需求的色谱柱。
安捷伦色谱柱主要有液相色谱柱和气相色谱柱两大类，涵盖了分子筛柱、反相柱、离子交换柱、氨基酸柱等各种类型。
以下是对其中一些常用色谱柱类型的详细介绍：1.反相柱（C18、C8等）：反相柱是液相色谱柱中应用广泛的类型之一，它的固定相通常是疏水性的烷基链（如C18、C8等），适用于非极性或弱极性化合物的分离。
安捷伦的反相柱具有较高的分离效果和使用寿命，能够提供良好的保留和分辨能力。
2.离子交换柱：离子交换柱可以根据溶液中离子的电荷和大小进行选择，可分为阳离子交换柱和阴离子交换柱。
它们广泛应用于药物分析、环境分析和生物样品分析等领域。
安捷伦的离子交换柱具有良好的耐酸碱性和高分辨能力，可有效分离带电离子和无机离子。
3.氨基酸柱：氨基酸柱是一类特殊的反相柱，其固定相是在C18固定相的基础上修饰上了特殊的萘乙酰氨基酸萃取相。
这种柱材具有特异性和选择性，特别适用于氨基酸的分离和分析。
4.手性柱：手性柱是用于分离和分析具有镜像异构体的化合物。
安捷伦色谱柱的手性柱具有优良的立体选择性和分离能力，适用于手性药物、香精香料、农药等领域的研究。
在选择安捷伦色谱柱时，需要综合考虑以下几个方面：1.样品特性和分析目标：根据样品的性质和分析目标确定使用的色谱柱类型。
如反相柱适合非极性和弱极性化合物的分离，离子交换柱适用于阳离子和阴离子的分析。
2.分析条件和分离效果：考虑分析条件（如流速、温度等）对色谱柱性能的影响。
根据分析条件来选择具有适当相容性和稳定性的柱材。
3.样品矩阵和交叉污染：如果样品矩阵复杂或存在交叉污染问题，可以选择具有更好选择性和保持高分辨能力的色谱柱。
超高效液相色谱柱长度
超高效液相色谱柱长度全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：超高效液相色谱（UHPLC）是一种高效的色谱技术，能够在较短的时间内分离出复杂混合物中的化合物。
在UHPLC中，色谱柱的长度是一个重要参数，它会直接影响到分析的分辨率、灵敏度和分离速度。
本文将介绍关于超高效液相色谱柱长度的一些重要知识。
色谱柱的长度对于分离的分辨率具有很大的影响。
色谱柱的长度越长，样品在色谱柱中的分布时间也就越长，这样就有更多的时间来实现化合物之间的有效分离。
较长的色谱柱可以提高分析的分辨率，使得分析结果更加准确和可靠。
在实际应用中，如果需要对复杂混合物进行细致的分析，可以选择较长的色谱柱以获得更好的分辨率。
色谱柱的长度还会影响到分离的速度。
较长的色谱柱会增加分析的时间，从而降低分离的速度。
在一定程度上，为了获得更好的分辨率和灵敏度，可能需要牺牲一部分分离的速度。
在选择色谱柱的长度时，需要考虑到分析的要求和时间成本之间的平衡。
在实际应用中，根据具体的分析需求和样品性质，可以选择合适长度的色谱柱。
一般来说，对于简单的样品，可以选择较短的色谱柱以提高分析的速度；而对于复杂的样品，可以选择较长的色谱柱以获得更好的分辨率和灵敏度。
色谱柱的长度是影响UHPLC分析性能的重要参数之一。
在实际应用中，需要根据具体的实验要求和样品性质来选择合适长度的色谱柱，以获得最佳的分析结果。
希望通过本文的介绍，读者对超高效液相色谱柱长度有更深入的了解，并能够在实验中更加灵活地选择适合的色谱柱长度。
第二篇示例：超高效液相色谱（UHPLC）是一种高效、快速的色谱分析技术，其已被广泛应用于药物研发、环境监测、食品安全等领域。
而在UHPLC 中，色谱柱的长度是影响分离效果和分析速度的重要因素之一。
本文将从色谱柱长度对分离效果的影响、选择色谱柱长度的原则以及常见的超高效液相色谱柱长度等方面展开讨论。
1. 色谱柱长度对分离效果的影响色谱柱长度是影响分离效果的重要因素之一，一般情况下，色谱柱长度越长，分离效果越好。
如何选择色谱柱
如何选择色谱柱，比较一下C-18及C-8柱的硅烷基质C-18和C-8硅烷色谱柱是高效液相色谱（HPLC）中最常使用的色谱柱，而且，在美国市场上有多于100种C-18和C-8色谱柱出售。
面对这么多可供选择的色谱柱，分析工作者很难从中选出适当的色谱柱来具体使用，同时更难选择出一根合适的替换柱。
对于非极性样品（如小分子芳烃）或弱极性样品（如对羟基苯甲酸酯），C-18和C-8色谱柱是最容易选择的。
对于这类样品，色谱柱之间的主要差异在于保留因子（k）；而在选择性方面却只有微小的差异。
但对于极性和中等极性样品色谱柱的选择却相当困难。
例如含氨基或酸性基团的药物化合物。
分析工作者会发现极性样品在保留时间、选择性和峰形都有很大的差别。
色谱柱的选择性和峰形受到担体硅胶的影响远大于键合相的影响。
另外，有研究报道在反相色谱中表面硅烷醇、硅酸及金属杂质的影响。
在特殊情况下，选择性的差异可由填料制备时使用的键合过程决定的。
通常情况下，色谱工作者选择HPLC色谱柱是通过比较由色谱柱供应商所提供的填料介质的规格来决定的。
这些规格内容包括：表面积、末端封尾、含碳量、颗粒形状、颗粒尺寸、孔径、孔容积、装填密度和键合度。
含碳量和键合度仅由色谱制造商提供，没有这些规格使用者不可能计算出碳的克数，也不可能计算出一根色谱柱中键合相的微分子数。
分析工作者可使用这两个数据来估计一根色谱柱的疏水性质。
然而，即使制造商提供所有上述规格数据，使用者也不可能精确地预测出色谱柱对含有极性官能团的化合物的选择性。
由于色谱的保留时间是基于分析物和填充基质之间许多微妙的相互作用，我们建议使用混合物测试来比较填充基质的规格与性能。
Engelhardt 和他的同伴回顾了硅烷反相色谱的特性，并且提出用溶解物试验来描述固定相的疏水性和亲硅基醇特性。
另外有一些人也改进了测试条件和方法来解释那些色谱数据，但他们只测试了很少的商品色谱柱，并且在他们的测试混合物中没有羧酸。
怎样选择合适的液相色谱柱
HPLC色谱柱一、色谱分离模式——正相、反相、离子交换、离子抑制、亲水作用正相色谱是色谱的经典形式，使用极性固定相和非极性流动相。
洗脱物通过其极性基团和固定相上的极性基团作用被保留。
这种应用，经典的是使用未键合的硅胶和氧化铝，但现在使用的极性键合相有以下优点：键合相平衡快，对流动相中微量的水不敏感，和产生不同的选择性。
二醇基键合相比纯硅胶极性小，平衡速度快；氰基键合相是保留能力最小的正相吸附剂；氨基键合相适宜分离芳香族碳氢化合物反相色谱已成为最流行的色谱分离模式。
反相色谱中，固定相非极性，流动相极性。
典型的流动相一般是水或水系缓冲液与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合物。
典型的固定相是用脂肪烃硅完化的硅胶键合相，其它用于反相色谱的基质有石墨化碳和苯乙烯-二乙烯苯基质。
反相色谱的性能还受残留的硅醇基的活性的影响。
硅醇基与洗脱物的极性基团作用。
因此，根据硅醇基的活性不同，填料显示出不同的选择性。
而且，常能观察到碱性物质在硅醇基活性高的填料上产生拖尾峰。
修饰硅醇基活性的一个办法是封端，即用硅烷化试剂把硅醇基转变成三甲基甲硅烷基基团。
不过，即使是作了封端，基质表面的硅醇基密度还是比键合配基的密度大。
硅醇基的活性也和硅胶的预处理（基质灭活）、硅胶纯度有关。
碱性分析物的色谱分析推荐使用高纯度硅胶基质、充分封端的键合相。
未封端的填料在许多应用中有可以获得不同选择性的优点。
使用带有离子电荷的固定相，使根据洗脱物电荷进行分离成为可能。
对于硅胶基质的离子交换填料，离子基团通过标准的硅烷化技术键合到硅胶表面。
对于聚合物基质的离子交换填料，离子交换基团分布于交联聚合物的整体（through the matrix）。
有四种离子交换填料：强/弱阳离子交换填料和强/弱离子交换填料。
弱离子交换填料的特征是电量与pH值有函数关系。
以羧酸基为功能基的离子交换剂是弱阳离子交换剂的代表。
弱阴离子交换剂由一级、二级、三级铵为功能基。
大部分强离子交换剂的电荷与pH值无关。
常用液相色谱柱选择
常用色谱柱简介气相色谱毛细柱（键合，聚二甲基硅氧烷）HP-1，DB-1，P-1，CP-SIL5CB，Ultra-1,007-1,RTx-1,AT-1类似固定相：SE-30，SP-2100，OV-1，OV-101,使用温度：-60℃-320℃应用范围：烷烃，芳烃，多环芳烃，醇，酚，酮，酯，醛，胺，卤代烃，吡啶，糖衍生物，氨基酸衍生物，维生素衍生物，镇痛药，农药，溶剂，胆固SPB-50型中等极性柱醇，香料，咖啡，食品添加剂等。
(键合, 50%二苯基,50%二甲基聚硅氧烷)对照品牌：HP-50，HP-17，DB-17，RTx-50，AT-50 SPB-5型弱极性柱类似固定相：OV-17, SP-2250,使用温度：30℃-310℃（键合，5%苯基，95%甲基聚硅氧烷）应用范围：烷烃，低沸点芳烃，多环芳烃，醇，甘对照品牌：HP-5，DB-5，BP-5，CP-SIL 8CB，油三酸酯，喹啉，卤素化合物，香料，农药，酯，Ultra-2, ,RTx-5,AT-5镇痛药，除草剂等。
类似固定相：SE-54，SE-52，OV-73 使用温度：-60℃-320℃PTE-5，PTE-5QTM型弱极性柱应用范围：烷基苯，多环芳烃，醇，酚，酮，脂肪(MS专用柱,键合,5%苯基,95%甲基聚硅氧烷)酸酯，苯二甲酸酯，硝基芳烃，芳胺，烷基胺，联对照品牌：HP-5 MS，DB-5 MS, DB-5.625，XTI-5，苯胺，卤代烃，多氯联苯，，糖类衍生物，维生素衍BPX625，半挥发污染物分析柱（US EPA方法525，生物，有机酸，镇痛药，农药，抗组胺药，溶剂，625.5，625）生物碱，防腐剂，香料等。
类似固定相：SE-54,SE-52 使用温度：-60℃-320℃应用范围：多氯联苯，胺，有机磷，有机氯农药，SUPELCOWAX 10型极性柱含氯除草剂，酚，苯胺，香料等。
(键合,聚乙二醇二万)对照品牌：HP-Wax，DB-Wax，BP-20，CP-Wax 52CB，SPB-1701型中等极性柱HP-INNO Wax,AT-Wax(键合, 14%氰丙基,86%二甲基聚硅氧烷)类似固定相：PEG-20M, CARBOWAX-20M,使用温对照品牌：HP-1701，DB-1701，RTx-1701，AT-1701，度：35℃-280℃BP-10，CPSil19CB应用范围：低沸点芳烃，醇，酮，酸，酯，醛，醚，类似固定相：OV-1701,SP-2250 使用温度：室温-280乙二醇，丙二醇，甘油，吡啶，胺，亚硝胺，卤代℃烃，胆汁酸衍生物，冰片，薄荷，精油，香料，酒，应用范围：醇，卤素化合物，有机氯农药，酸性药苯乙烯，茶，溶剂等。
HPLC色谱柱的种类
高效液相色谱柱大致可分为五类:一、高效反相液相色谱柱以C18为代表的高效反相液相色谱柱•直被描述为药物发现、开发、方法验证(ValidatiOn)的心脏!高效反相液相色谱柱也极其广泛应用在药物代谢及动力学、生命科学、医疗健康、生物分析检测、毒品和兴奋剂检测、食品安全分析、环境分析、军事、国土安全等领域！高效反相液相色谱制备柱也是最重要的分离纯化技术之一！无论是过去，现在和可预见的未来，以球形B型硅胶(5Um或3um)为材料骨架的高效反相液相色谱柱在实际应用中永远占有统治地位!常规HPLC方法的开发几乎总是从C18作为出发点，反相色谱占了80%以上的应用。
过去数十年来，无数努力集注于：1)改善硅胶的品质，优化键合化学；2)开发新颖的材料骨架替代硅胶。
十多年前，使用有机硅材料取代无机硅材料作为起始原料生产球形硅胶代表一个划时代的革命！生产的球形硅胶命名为B型球形硅胶。
无机A型硅胶重金属含量很高，硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等导致许多碱性化合物回收率低。
球形B型硅胶重金属含量很低，在非常大的程度上消除了A型无机硅胶表面若干位置严重酸化及螯合效应等问题。
用B型球形硅胶合成高效液相色谱填料，导致高效液相色谱柱产品质量有质的飞跃！然而，另一方面，基于客户的大量反馈和我们对几乎所有色谱厂商产品的评估，我们相信键合化学问题没有获得很好的解决。
具体体现在：(1)“纯粹”反相机理的键合相例如C18和C8市场上仍然是单功能，三功能和聚合物键合相”鱼目混杂(2)键合相封端问题没有获得很好的解决，•直是困扰色谱领域最大的问题！迄今为止全部的尝试只获得有限的成功。
(3)极性嵌入式(PolarCmbCddCd)键合相极性嵌入式(PoIarCmbCdded)键合相是C18高效反相液相色谱"卫星群”中最重要的产品，是C18和C8键合相最重要的补充。
极性嵌入式(POIarembedded)键合相起源于SupelcoABZ o SupelcoABZ的键合方法是用aminopropyl键合相和长链按酸缩合反应形成一个C16酰胺。
液相工作中的色谱柱选择
mAU
20
As 1.15
与其它C18s色谱柱保留相近
2 .0 2.5 M in u t e s 3 .0 3.5 4 .0 4.5 5 .0
10
0 0 .0 0.5 1 .0 1.5
40
Gemini C18
更好的对称性
所有色谱柱 150 x 4.6mm, 5µm 流动相: H2O/MeCN, 60/40 流速: 1.0mL/min 柱温: 25°C 检测器: UV@ 254nm 进样量: 5L 目标物: 1. 吡啶 2. 苯酚
• 工作类型
• 常规检测 • 新方法开发
• 仪器类型
• 色谱 • 色谱质谱 谱 谱
5
常规检测的色谱柱选择
——与柱效、分离度有关的关键色谱柱参数
常见问题
7
原因分析
• 表面含有大量硅醇基 • 金属离子含量高 • 通常没有封端
Si-OH -- X
•碱性化合物 Si-OH -- NH2-R（氢键） Si-O---+NH3-R （离子交换 离子交换 ） •酸性化合物 Si-OH Si OH -- O O=RCOH RCOH
5.0
ZORBAX Eclipse Plus C18
30 mAU 20
As 1.21
ห้องสมุดไป่ตู้10
0 0.0 0.5 1 .0 1 .5 2.0 2.5 M in u t e s 3 .0 3 .5 4.0 4.5 5 .0
11
常见问题
12
原因分析
柱 柱效
去甲替林 普萘洛尔 萘磺酸
质量过载(0.1~5μg)
液相工作中的色谱柱选择
2014 年 4 月
Thermo Scientific 色谱柱系列概览
色谱柱的选择与维护
Si O Si O Si O H
Si O Si O Si O
OH
O CH3
OH (CH ) Si-R Si O CH 3 3 2 OH CH3 O
水 解
Si O
R-Si(CH3)2-X
Si O Si O Si O Si O
O Si O Si O O O O O O O O O O Si O Si O O Si O Si O O Si O Si O
13
色谱柱填料特性
1、 柱填料 • 硅胶纯度（酸性A型和高纯B型） • 粒径（1.7、1.8、2.0、2.7、3、5um） • 碳载量（2-27%） • 比表面积（200-450m2 /g） • 孔径（60、90、100、150、200、300、500、1000Å） 2、 色谱柱的构型 • 色谱柱直径 • 色谱柱长度 3、 固定相 • 键合类型 • 残余硅羟基的影响（封尾） • 反相键合相的保留行为（重现性） • 键合硅胶的稳定性
Halo :
4.6×50mm 2.7μm 乙腈－水梯度,1.5ml/ml 仪器：Shimadzu 10A VP系统
shimadazu column :
Shim-pack-ODS 3.0×50mm 2.2 μm 乙腈－水梯度,1.4ml/ml MAX pressure 23MPa 仪器：Prominence UFLC
羟基pH约为3.5 更对称的峰型
• 硅胶表面更均匀－硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖
重现性更好
• 表面纯度更高－硅胶金属杂质被覆盖
极性化合物保留和分离更好
25
基于双层表面处理技术的色谱柱
Venusil MP C18: 通用的C18色谱柱，可适应大多数应用。
高效液相色谱柱的选择、使用与维护
醋酸 二 甲基 辛胺 ） ； Ｃ降低进 样量 至 ≤ｌｇ ． ｕ。 ４２２ 与色谱 柱有 关 的拖尾 问题 ．． ａ如柱 头处 有强 保 留的样 品组 分 积 聚 ， 相 柱 ． 反 可 用 ２ 柱体 积的 ９ ％ 的二碌 甲烷 与 ４ 甲醇 ， ０倍 ６ ％ 加 １ 氢氧化 铵混 合液 冲洗 ， 向柱可用 甲醇 冲洗 。 ％ 正 ｂ使 用保 护柱 。 ．
４ ２３ 与 Ｈ Ｌ ．． Ｐ Ｃ系统有关的峰拖尾和峰加宽
ａ进样 体 积过大 ，通 常 ＜２ｕ ） ． （ ￣ ５Ｌ ；
ｂ 进样阀与色谱柱及检测器之间的管路体积过 ． 大（ 最佳连接管应 ￣ ０ｍ， ＜ ｃ 内径为 ００ ７） ２ ．０ ” ；
Ｃ ．检测 器流 通池 的体 积过大 。 ５ 色谱 柱 的储存 ① 防止缓 冲溶 液 和 水溶 液 流 动 相 产生 微 生 物 ，
谱柱有一部分经简单 的方法进 行清洗后 ， 可恢 复部 分甚至大部分离能力 ， 不仅节省资源 ， 还能大大降低 分离分析的成本 。 色谱柱的选择 、 使用与维护方面的研究具有 十 分重要的现实意义 ， 也一直是色谱工作 者和仪器厂 商关注的热点。很多色谱专著介绍过相关知识 ， 并 提出许多简单有效的方法 ， 色谱柱 厂商也推荐对 各 应其商品色谱柱的经验性方法。
１ 液相 色谱柱 的填 料 １１ 硅胶 基质 填料 ． １１ １ 正相 色谱 ．．
正相色谱用的固定相通常为硅胶 （ｉｃ） 以及 Ｓｉ ， ｌａ 其他具有极性官能团 ， 如胺基 团（ Ｈ ， Ｐ ） Ｎ Ａ Ｓ 和氰基 团（ Ｎ Ｃ Ｓ 的键合相填料 。由于硅胶表面 的硅羟 Ｃ ，Ｐ ）
可 能在 使 用时 与填 料 发 生 相 互 作 用 ， 些 被 吸 附 的 这 杂 质 累积 到一定 程 度 后 会 形 成 新 的伪 固定 相 ， 而 从 改 变 色谱 柱 的性 能 。对 于 基质 复 杂 的样 品 ， 根 色 一
安捷伦的色谱柱的介绍及选择
D250oC O2 孔径
80A & 300A
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
ZORBAX Rx
多孔硅胶微球
安捷伦拥有此项填料专利技术
8
Agilent LC colmns
4
Zorbax主要的键合相
Zorbax硅胶颗粒
StableBond
二异丙基 二异丁基键合
Rx-C18/Sil
Zorbax Eclipse XDB-C18 (B类硅胶)
普通硅胶（A类）
由于带负电荷的残留硅羟基和酸 性表面上金属含量高 (硅羟基的 pKa低), 导致碱性化合物发生拖 尾
高纯硅胶 (B类)
ZORBAX SB-C18 (B类硅胶)
由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
ODS (A类硅胶) 封端
Eclipse StableBond
柱装填
• 具可追溯性 • 可定购生产批号不同的色谱柱 • 特殊规格定制ExtendBo Nhomakorabeaus RP
4
Agilent LC colmns
2
ZORBAX®硅胶类型
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面 上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致 碱性化合物发生拖尾
高通量和LC/MS柱
Zorbax 高通量柱，LC/MS 色谱柱 Zorbax 快速分离柱 Zorbax 快速分离高通量柱 Zorbax 溶剂节省色谱柱 Zorbax 微径色谱柱 Zorbax 毛细管柱和纳流柱
生化分析柱
Zorbax 300 SB 柱 Zorbax 300Extend柱 Zorbax Poroshell柱 Zorbax Eclipse AAA柱 Zorbax GF-250/450 凝胶柱 Zorbax Oligo HPLC柱 Zorbax SAX和SCX柱 MARS mRP column
高效液相色谱柱基础知识
色谱柱的种类
➢ 高分子聚合物 • 常用的是以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙
烯酸酯为基质的球形填料。 • 压力限度比无机填料低； • 在整个pH范围内稳定，可以用NaOH或强碱来清洗
分离有机酸、碱、盐这些离子型化合物。 ➢ 样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可
使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择 性；短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极 性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键 合相与短链烷基键合相的性质相似。
反相键合相色谱
流动相为极性的水或缓冲液，常加入甲醇、 乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶 的有机溶剂以调节保留时间。
ZORBAX Extend-C18，pH9~12, ➢ 基质的颗粒度 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)，分离度越好，柱压
越高(渗透性差)，常用5μ。 ➢ 基质的颗粒分布 颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差) ➢ 基质的颗粒形状 球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型（不规则形状）：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀，
色谱柱 ； • 聚合物基质在流动相发生变化时会出现膨胀或收缩，
对于小分子化合物柱效低； • 主要用于大分子化合物，常制成凝胶柱或离子交换
柱。
化学键合相色谱柱
➢ 定义：将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶 表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。
➢ 种类 非极性键合相（反相）：键合相表面基团为非极性
高效液相色谱柱基础知识
张润平
色谱柱的构造
✓ 色谱柱由柱管、填料压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、 于70 kg/cm2 时，也可采用 厚壁玻璃或石英管。为提高柱效，减小管壁效应，管内壁要求 有很高的光洁度，不锈钢柱内壁多经过抛光。
hplc药物浓度检测步骤
hplc药物浓度检测步骤
HPLC（高效液相色谱）是一种常用的药物浓度检测技术，其步骤如下：
1. 样品制备：根据药物特性选择合适的样品制备方法，例如萃取、稀释等。
确保样品是可用于HPLC分析的合适溶液。
2. 色谱柱选择：根据药物的化学性质和分离要求选择合适的色谱柱，比如反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
3. 准备移动相：根据药物特性和色谱柱的要求，准备合适的移动相，通常是一个有机溶剂和缓冲盐溶液的混合物。
4. 样品进样：将经过制备的样品注射到色谱柱中。
通常使用自动进样器来控制进样量和重现性。
5. 色谱条件设置：根据需要，设置适当的色谱条件，如流速、梯度程序、温度等。
6. 柱温控制：根据样品的性质和分析要求，设置适当的柱温。
7. 检测器选择：根据药物的特性选择合适的检测器，常用的有紫外-可见光检测器、荧光检测器等。
8. 数据采集和分析：通过连接到色谱仪的数据处理软件，采集和分析色谱图，获取药物的峰面积或峰高度。
9. 定量计算：根据标准曲线，计算药物浓度。
通常使用内标法或外标法进行定量。
10. 结果报告：将测得的药物浓度结果进行整理、分析和报告，评估样品的合格性和适用性。
注意：以上步骤只是一般的HPLC药物浓度检测步骤，具体
操作可能会因药物的特性、分析目的和仪器设备的不同而有所不同。
安捷伦的色谱柱的介绍及选择
Agilent LC colmns 1提高分离速度，节约分析成本安捷伦液相色谱柱介绍与选择OUTLINE安捷伦液相色谱柱介绍及选择建议如何提高液相色谱分离效率安捷伦新一代常规分析柱Agilent LC colmns2Agilent LC colmns 3常规分析柱Zorbax Eclipse Plus 柱Zorbax Eclipse XDB Zorbax Stable Bond 柱Zorbax Extend C18柱Zorbax Bonus-RP 柱Zorbax SB-Aq 柱Zorbax RX HPLC 柱原先的Zorbax ODS 柱Zorbax 正相柱其他Zorbax 柱生化分析柱Zorbax 300 SB 柱Zorbax 300Extend 柱Zorbax Poroshell 柱Zorbax Eclipse AAA 柱Zorbax GF-250/450 凝胶柱Zorbax Oligo HPLC 柱Zorbax SAX 和SCX 柱MARSmRP column高通量和LC/MS 柱Zorbax 高通量柱，LC/MS 色谱柱Zorbax 快速分离柱Zorbax 快速分离高通量柱Zorbax 溶剂节省色谱柱Zorbax 微径色谱柱Zorbax 毛细管柱和纳流柱制备柱Zorbax PrepHT 制备柱Zorbax ®液相色谱柱常规分析柱Agilent TC /HCAgilent TC/HC (2)Agilent ®液相色谱柱制备柱Agilent prep 制备柱Agilent LC colmns4安捷伦Zorbax ®HPLC 色谱柱严格的质量控制产品研究与开发硅胶生产键合柱装填•具可追溯性•可定购生产批号不同的色谱柱•特殊规格定制StableBondEclipseBonus RP ExtendAgilent LC colmns 5二氧化硅Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr ZnZorbax Rx-SIL 10< 34 1.52nd 3nd nd nd 1Zorbax SIL 17nd nd 579322188< 1nd 88Nucleosil 56N/A N/A nd 1305776nd N/A N/A ndHypersil 2900N/A 403003865230N/A N/A N/A N/And = 未检出金属浓度（ppm)A 类硅胶Original ZORBAX SIL (1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa 低), 导致碱性化合物发生拖尾B 类硅胶(高纯)ZORBAX Rx-Sil (1987)由于金属含量低, 硅羟基pKa 高,碱性化合物不发生拖尾Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质, <1ppm); 99.995% 纯度的二氧化硅ZORBAX ®硅胶类型Agilent LC colmns6选择适用于pH7.5流动相的色谱柱流动相:乙腈: 50 mMK 2HPO 4: 55: 45, pH 7.5UV: 224 nm 23°C进样量: 20 µL (0.5 µg / µL)Zorbax Eclipse XDB-C18 (B 类硅胶)ZORBAX SB-C18(B 类硅胶)ODS (A 类硅胶)封端ODS (A 类硅胶)不封端普通硅胶（A 类）由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa 低), 导致碱性化合物发生拖尾高纯硅胶(B 类)由于金属含量低, 硅羟基pKa 高,碱性化合物不发生拖尾Agilent LC colmns7硅胶填料－液相色谱柱的基础……Zorbax 液相色谱柱硅胶特点Zorbax 硅胶的制备方法由液相色谱柱著名创始人J.J. Kirkland 发明，属于安捷伦公司的专利技术。
高效液相色谱柱
其他无机物填料柱
这类色谱柱仅限于特殊用途，主要有石墨化碳、氧化铝（Al2O3）、氧化锆（ZrO2） 等填料。不需要进行表面改性，其自身表面即可对各类化合物有强保留。可在任意pH （氧化铝除外，不能大于12.0）及高温度（可达100℃）下使用。其中，石墨化碳填料
柱能分离多种化合物，主要用于分离几何异构体；氧化铝柱刚性强，柱床稳定，可分离 多种化合物且多用于制备色谱；氧化锆柱较氧化铝柱有更强的pH适用范围及能耐受更高 的温度，但其应用尚待进一步研究。
2.液相色谱柱的分类与应用范围
分类方法很多，可按键合相类型、用途（分析型与制备型）、基质种类 等进行分类。 硅胶基质柱（4大类）：
目前，分析型液相色谱柱多为硅胶基质柱，细分为： 高纯硅胶柱：以高纯度硅烷化硅胶（ Silica ）为填料，应用范围较广，但只能在 PH2.0-7.5，小于60度的条件下使用。又由于强极性硅羟基（Si-OH)的次级保留效 应较强，所以应用受到局限，已被键合相柱所取代。 反相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合弱极性官能团的固定相。目前多 用C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（phenyl，苯基）等。用于分离大 多数有机化合物，应用范围最广。 正相硅胶柱：是以硅烷化硅胶为基质，表面键合极性官能团的固定相。目前较多 的为：NH2—（氨基）、CN—（氰基）、DIOL（二羟基，也常做HILIC单独分类 列出，多用于分离有机酸、蛋白质等）。多用于分离光学异构体和反相柱子不能 分离的极性比较大的物质 。
③特别说明：如不是特殊情况，按其他办法可行，则最好不要反冲色谱柱和拆卸筛板。
（2）柱效降低：主要特征性现象有柱压基本正常，但出现拖尾峰、秃峰、分叉峰、 前延峰、峰变宽、基线漂移、理论板数降低、分离度降低等。需要进行再生处理，具 体方法如下：
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障的排除
液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。
正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。
另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。
本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择
1．柱子的PH值使用范围
反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。
但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。
一般的C18柱PH值范围都在2~8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。
一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。
同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。
如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。
2．填料的端基封尾（或称封口）
把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。
如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。
3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱
戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。
PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。
尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。
对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有更好的立体选择性。
（下图是Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较）
二、液相色谱柱的使用
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。
在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。
1、样品的前处理
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长期留在柱中)。
b、流动相与样品不产生化学反应
c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。
如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。
除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，
还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
3、流动相流速的选择
因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。
对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。
对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。
当选用最佳流速时，分析时间可能延长。
可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：a．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。
最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
b．流动相要求使用0.45 μm滤膜过滤，除去微粒杂质。
c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。
三．色谱柱的维护
1. 色谱柱的平衡
反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。
新柱应先使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。
请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。
每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！操作步骤：
a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）
b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡；分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。
2．色谱柱的再生
长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。
可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。
建议用来冲洗柱子的溶剂体积
色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积
125-4mm 1.6ml 30ml；250-4 mm 3.2ml 60ml；250-10mm 20ml 400ml 选择再生方法：极性固定相（如Si，NH2* ，DIOL基色谱填料）的再生：正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**；非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水。
注意：a. 在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
b. 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
</P>
3. 色谱柱的维护
a．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）
b．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
c．避免流动相组成及极性的剧烈变化
d．流动相使用前必须经脱气和过滤处理
e．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中
f．氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。