抗生素微生物检定法PPT课件
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▪ 琼脂球面扩散动力学 公式：
▪ 奠定了管碟法量反应 直线公式的基础
r2 = 4 D T ln M /H ln C ln 4D T
lgM= 1 r2lgC4DTH
9.21DT
抗生素微生物检定法的概况
▪ 微生物检定法的特点 ▪ 1.微生物检定法可直观、特异wenku.baidu.com地反映出抗生
素药品的抗菌活性，显示临床的特点；
▪ 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍 复试。
二剂量法计算
P=log1T T2 2 T S12ST21 S S1 1I100%
结果计算及判断
检定的影响因素
抗生素微生物检定法
定义：抗生素微生物检定法是利用抗生素在 低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的 特点，以微生物的抗菌活性为指标，来衡 量抗生素中的有效成分效力的方法。
方法：本法是在适宜的条件下，根据量反应 平行原理设计，通过检测抗生素对微生物 的一直作用，计算抗生素活性（效价）的 方法。
量反应平行原理
结果 ▪ 易于操作，比浊仪在线培养和测定，具有
客观、精密便于自动化操作的优点 ▪ 采用液体培养基，无扩散因素的影响，试
验的灵敏度高，结果的精密度和正确度都 较扩散法好
浊度法
▪ 缺点： ▪ 对试验仪器的性能及试验器具的要求较高，
如培养温度要求一致，比色管的清洁等 ▪ 任何影响液体培养基内微生物生长的因素都
试验准备
底层的制
备
供试品、标准品溶液的制备
菌层的制备
加钢圈
滴加抗生
素溶液 培养 抑菌圈的测量
结果的可靠性检验及效价测定
管碟法的操作步骤
▪ 预试验 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、
使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的 抑菌圈直径应在16~17.5cm，二剂量法高 剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在 18~22cm，三剂量法中间剂量浓度标准品 溶液所致的抑菌圈直径在15~18cm。
试验准备
试验准备
管碟法的操作步骤
▪ 培养基的制备
管碟法的操作步骤
▪ 底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
管碟法的操作步骤
▪ 加钢圈 ▪ 滴加抗生素溶液
培养
▪ 温度：一般为 36~37℃
抗生素微生物检定法
*** ***药品检验所
抗生素检测技术专题研讨班概况
▪ 《中国药典》2010版抗生素检测技术与方法概述 ▪ 《中国药典》2010版抗生素有关物质检测 ▪ 残留溶剂测定法 ▪ 抗生素聚合物检查 ▪ 《中国药典》2010版抗生素溶出度方法介绍 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 《中国药典》2010版抗生素质量标准建立概述 ▪ 抗生素药品质量标准提高的价值与技术策略
会影响抗生素效价的测定
管碟法
▪ 利用抗生素在固体培 养基中的平面扩散作 用，依据量反应平行 原理并采用交叉实验 设计方法。在相同的 试验条件下通过比较 标准品（已知效价） 和供试品两者对所接 种试验菌产生的抑菌 圈（直径或面积）的 大小来测定供试品效 价的一种方法
管碟法
▪ 管碟法的操作步骤
预试验
生素的效价
抗生素微生物检定方法比较
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的 固体培养基内成球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖 而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一 定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径 （面积）呈直线关系而设计，通过检测抗 生素对微生物的抑制作用，比较标准品与 供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品 的效价。
▪ 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选 择性差，效价测定受其他成分的影响。
▪ 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺 作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使 样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的 剂量反应曲线偏离，无法测准妥布霉素的 含量。
抗生素微生物检定法分类
▪ 1.稀释法 ▪ 2.浊度法 ▪ 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） ▪ 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 比浊法：通过监测等量的试验菌菌液在不 同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况， 利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素 的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑 菌效力的发疯，可用于抗生素药物的含量 （效价）测定。
浊度法与管碟法方法比较
浊度法
▪ 优点： ▪ 速度快，试验过程3-4小时，可在当天获得
▪ 剂间（F6）：不同浓度间的差异是否 显著。P＜0.01
▪ 碟间（F7）：同一浓度间差异是否显 著。 P＞0.05
结果计算及判断
▪ 重试判定
▪ 抑菌圈大小的要求
▪ 可靠性检验：符合可靠性检验的各项规定
▪ 可信限率：供试品效价测定结果（PT）的 可信限率除特殊规定外，不得大于5%。
▪ 实测效价与估计效价：应在90~110%之间， 否则结果仅作为初试，应予以重试。
▪ 2.多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的 差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、 寒冷和活性的关系；
▪ 3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当 的分析方法测定其效价；
▪ 4.同时微生物法所需仪器设备简单，成本较低。
微生物检定法的局限性
▪ 本法测定的是有抑菌作用物质的总效价， 测定结果不能反映药品的纯度，不能排除 其他组分或活性杂质的干扰。
▪ 时间：一般为16~18h
结果计算及判断
结果计算及判断
▪ 抑菌圈的测量以及结 果的可靠性检验及效 价测定
多功能微生物自动测量分析仪
结果可靠性分析
▪ 试品间（F1）：供试品的估计效价是 否合适。P＞0.05
▪ 回归（F2）：剂量反应关系是否成立。 P＜0.01
▪ 偏离平行（F3）：量反应直线的斜率 是否有显著差异。P＞0.05
抗生素药品的特点
▪ 纯度一般较化学药品低 ▪ 发酵类产品通常为多组分且活性组分易发
生变异 ▪ 稳定性一般较化学药品差 ▪ 结构较一般化学药品复杂
抗生素检测技术与方法
▪ 高效液相色谱法 ▪ 高效毛细管电泳法 ▪ 气相色谱法 ▪ 高分子杂质测定法 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 溶出度 ▪ 不溶性微粒 ▪ 澄清度 ▪ 溶液颜色
▪ 奠定了管碟法量反应 直线公式的基础
r2 = 4 D T ln M /H ln C ln 4D T
lgM= 1 r2lgC4DTH
9.21DT
抗生素微生物检定法的概况
▪ 微生物检定法的特点 ▪ 1.微生物检定法可直观、特异wenku.baidu.com地反映出抗生
素药品的抗菌活性，显示临床的特点；
▪ 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍 复试。
二剂量法计算
P=log1T T2 2 T S12ST21 S S1 1I100%
结果计算及判断
检定的影响因素
抗生素微生物检定法
定义：抗生素微生物检定法是利用抗生素在 低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的 特点，以微生物的抗菌活性为指标，来衡 量抗生素中的有效成分效力的方法。
方法：本法是在适宜的条件下，根据量反应 平行原理设计，通过检测抗生素对微生物 的一直作用，计算抗生素活性（效价）的 方法。
量反应平行原理
结果 ▪ 易于操作，比浊仪在线培养和测定，具有
客观、精密便于自动化操作的优点 ▪ 采用液体培养基，无扩散因素的影响，试
验的灵敏度高，结果的精密度和正确度都 较扩散法好
浊度法
▪ 缺点： ▪ 对试验仪器的性能及试验器具的要求较高，
如培养温度要求一致，比色管的清洁等 ▪ 任何影响液体培养基内微生物生长的因素都
试验准备
底层的制
备
供试品、标准品溶液的制备
菌层的制备
加钢圈
滴加抗生
素溶液 培养 抑菌圈的测量
结果的可靠性检验及效价测定
管碟法的操作步骤
▪ 预试验 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、
使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的 抑菌圈直径应在16~17.5cm，二剂量法高 剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在 18~22cm，三剂量法中间剂量浓度标准品 溶液所致的抑菌圈直径在15~18cm。
试验准备
试验准备
管碟法的操作步骤
▪ 培养基的制备
管碟法的操作步骤
▪ 底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
管碟法的操作步骤
▪ 加钢圈 ▪ 滴加抗生素溶液
培养
▪ 温度：一般为 36~37℃
抗生素微生物检定法
*** ***药品检验所
抗生素检测技术专题研讨班概况
▪ 《中国药典》2010版抗生素检测技术与方法概述 ▪ 《中国药典》2010版抗生素有关物质检测 ▪ 残留溶剂测定法 ▪ 抗生素聚合物检查 ▪ 《中国药典》2010版抗生素溶出度方法介绍 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 《中国药典》2010版抗生素质量标准建立概述 ▪ 抗生素药品质量标准提高的价值与技术策略
会影响抗生素效价的测定
管碟法
▪ 利用抗生素在固体培 养基中的平面扩散作 用，依据量反应平行 原理并采用交叉实验 设计方法。在相同的 试验条件下通过比较 标准品（已知效价） 和供试品两者对所接 种试验菌产生的抑菌 圈（直径或面积）的 大小来测定供试品效 价的一种方法
管碟法
▪ 管碟法的操作步骤
预试验
生素的效价
抗生素微生物检定方法比较
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的 固体培养基内成球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖 而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一 定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径 （面积）呈直线关系而设计，通过检测抗 生素对微生物的抑制作用，比较标准品与 供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品 的效价。
▪ 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选 择性差，效价测定受其他成分的影响。
▪ 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺 作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使 样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的 剂量反应曲线偏离，无法测准妥布霉素的 含量。
抗生素微生物检定法分类
▪ 1.稀释法 ▪ 2.浊度法 ▪ 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） ▪ 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 比浊法：通过监测等量的试验菌菌液在不 同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况， 利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素 的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑 菌效力的发疯，可用于抗生素药物的含量 （效价）测定。
浊度法与管碟法方法比较
浊度法
▪ 优点： ▪ 速度快，试验过程3-4小时，可在当天获得
▪ 剂间（F6）：不同浓度间的差异是否 显著。P＜0.01
▪ 碟间（F7）：同一浓度间差异是否显 著。 P＞0.05
结果计算及判断
▪ 重试判定
▪ 抑菌圈大小的要求
▪ 可靠性检验：符合可靠性检验的各项规定
▪ 可信限率：供试品效价测定结果（PT）的 可信限率除特殊规定外，不得大于5%。
▪ 实测效价与估计效价：应在90~110%之间， 否则结果仅作为初试，应予以重试。
▪ 2.多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的 差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、 寒冷和活性的关系；
▪ 3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当 的分析方法测定其效价；
▪ 4.同时微生物法所需仪器设备简单，成本较低。
微生物检定法的局限性
▪ 本法测定的是有抑菌作用物质的总效价， 测定结果不能反映药品的纯度，不能排除 其他组分或活性杂质的干扰。
▪ 时间：一般为16~18h
结果计算及判断
结果计算及判断
▪ 抑菌圈的测量以及结 果的可靠性检验及效 价测定
多功能微生物自动测量分析仪
结果可靠性分析
▪ 试品间（F1）：供试品的估计效价是 否合适。P＞0.05
▪ 回归（F2）：剂量反应关系是否成立。 P＜0.01
▪ 偏离平行（F3）：量反应直线的斜率 是否有显著差异。P＞0.05
抗生素药品的特点
▪ 纯度一般较化学药品低 ▪ 发酵类产品通常为多组分且活性组分易发
生变异 ▪ 稳定性一般较化学药品差 ▪ 结构较一般化学药品复杂
抗生素检测技术与方法
▪ 高效液相色谱法 ▪ 高效毛细管电泳法 ▪ 气相色谱法 ▪ 高分子杂质测定法 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 溶出度 ▪ 不溶性微粒 ▪ 澄清度 ▪ 溶液颜色