抗生素微生物检定法PPT课件
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第七章 抗生素微生物检定法
2
管碟琼脂扩散法
抗生素管碟测定法是利用抗生素在摊布特定试 验菌的固体培养基内呈球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现
透明的抑菌圈。
3
该法根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂 量与抑菌圈的直径或面积呈线性关系，通过比较 标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试 品的效价。
8
（2）三剂量法
取双碟六个，在每个双碟内间隔的3个不锈钢管中 分别滴加高、中及低浓度的标准液，其余两个不锈 钢管中分别滴加高、中及低浓度的供试品溶液。三 个浓度的剂距比为1：0.8。35-37℃ 培养14-16h， 用游标卡尺测量抑菌圈直径。
9
7、结果判定
实验计算所得效价低于估计效价的90%或高
16
无菌检查法
3、随机抽取2份样品，无菌接种后，
分别在30-35℃和20-25℃培养7日。 4、结果判定： 无菌生长为符合规定。
17
第七章 抗生素微生物检定法 无菌检查法
第一部分 抗生素微生物检定法 第二部分 无菌检查法
1
第一节 抗生素微生物检定法
本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用， 比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑 菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 依试验设计原理不同，分为稀释法、比浊法、 琼脂扩散法。 中国兽药典采用管碟琼脂扩散法。
7
6、检定法
（1）二剂量法 取双碟四个，在每个双碟内对角线2个不锈钢管 中分别滴加高浓度及浓度的标准液，其余两个不 锈钢管中分别滴加高浓度及低浓度的供试品溶液。 高、低浓度的剂距比为2：1或4：1。35-37℃ 培 养14-16h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。滴加抗 生素溶液：滴加溶液至钢管口平满，滴加溶液间 隔时间不可过长 。
抗生素知识培训ppt课件
初级代谢：指生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢 和合成代谢，生成维持生命活动所必需的物质和能量的过 程，称为初级代谢。
次级代谢：某些生物为了避免在初级代谢过程某种中间产物 积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类 型。
.
第一部分：抗生素定义与分类
着抗生素研究工作的发展，抗生素可以是某些微生物生长繁殖过程中产生的一种 物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人 工合成的。现在通常把经过化学改造的天然来源抗生或微生物代谢的其他产 物，以低微浓度能够抑制或影响它种生物机能的化学物质通称为抗生素。
T共价结合形成二聚体，干扰DNA的复制和转录， 导致细菌的变异和死亡。 • 特点： • ①穿透力比较差。普通玻璃、纸张、尘埃等均可 阻挡紫外线，因此它只适用于空气消毒或物体表 面的消毒。 • ②紫外线可损伤皮肤、眼睛，使用时应注意防护。
.
• 3）滤过除菌法 • 4）超声波杀菌法 • 5）干燥与低温抑菌法
.
• 3.生物学消毒灭菌法
• 1）抗生素 临床治疗
• 2）细菌素 为微生物代谢产物，破坏同源 性细菌。
• 3）噬菌体 感染细菌、真菌、放线菌、螺 旋体等微
•
生物的病毒。
• 4）中草药
.
• 三、影响消毒灭菌效果的因素
• 1.消毒剂的性质、浓度与作用时间
• 2.微生物的种类与数量
• 3.温度
• 4.酸碱度
稀释法：通过观察不同浓度的抗生素抑 制试验菌的生长情况，从而测定抗生素最 低抑菌浓度。常用于新药研制及临床药敏 试验。
.
浊度法： 采用分光光度法测定不同浓 度的抗生素抑制试验菌的生长情况（混浊 程度），从而测定抗生素抑菌效力的方法。 该方法国外使用较为普遍，而且快速（3-4 小时），《中国兽药典》（2010年版）收 载了方法，如庆大霉素、链霉素、红霉素、 大观霉素、安普霉素、泰乐菌素。
次级代谢：某些生物为了避免在初级代谢过程某种中间产物 积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类 型。
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第一部分：抗生素定义与分类
着抗生素研究工作的发展，抗生素可以是某些微生物生长繁殖过程中产生的一种 物质，用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人 工合成的。现在通常把经过化学改造的天然来源抗生或微生物代谢的其他产 物，以低微浓度能够抑制或影响它种生物机能的化学物质通称为抗生素。
T共价结合形成二聚体，干扰DNA的复制和转录， 导致细菌的变异和死亡。 • 特点： • ①穿透力比较差。普通玻璃、纸张、尘埃等均可 阻挡紫外线，因此它只适用于空气消毒或物体表 面的消毒。 • ②紫外线可损伤皮肤、眼睛，使用时应注意防护。
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• 3）滤过除菌法 • 4）超声波杀菌法 • 5）干燥与低温抑菌法
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• 3.生物学消毒灭菌法
• 1）抗生素 临床治疗
• 2）细菌素 为微生物代谢产物，破坏同源 性细菌。
• 3）噬菌体 感染细菌、真菌、放线菌、螺 旋体等微
•
生物的病毒。
• 4）中草药
.
• 三、影响消毒灭菌效果的因素
• 1.消毒剂的性质、浓度与作用时间
• 2.微生物的种类与数量
• 3.温度
• 4.酸碱度
稀释法：通过观察不同浓度的抗生素抑 制试验菌的生长情况，从而测定抗生素最 低抑菌浓度。常用于新药研制及临床药敏 试验。
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浊度法： 采用分光光度法测定不同浓 度的抗生素抑制试验菌的生长情况（混浊 程度），从而测定抗生素抑菌效力的方法。 该方法国外使用较为普遍，而且快速（3-4 小时），《中国兽药典》（2010年版）收 载了方法，如庆大霉素、链霉素、红霉素、 大观霉素、安普霉素、泰乐菌素。
《抗生素知识培训》PPT课件
金黄色葡萄球菌（CMCC26003）等。
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51
12、标准品
标准品是指用于生物检定、抗生素或生化 药品中含量或者效价测定的标准物质，一 般以效价单位标示，标准品应由国家法定 的单位制备、标定和供应，一般常用的标 准品来源于中国兽医药品监察所和中国药 品生物制品检定所。
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52
三、管碟法操作步骤
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9
六、林可胺类 主要有盐酸林可霉素、盐酸吡利霉素等。
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10
七、多肽类
包括硫酸黏菌素、杆菌肽锌、亚甲基水 杨酸杆菌肽、恩拉霉素、维吉尼霉素、那 西肽等。
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11
八、多糖类 包括阿维拉霉素、黄霉素等。
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12
九、其他：
包括延胡索酸泰妙菌素、泰妙菌素、盐酸 沃尼妙林、赛地卡霉素等
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40
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41
可整理ppt
42
7、抑菌圈测定仪： 用于测定细菌所致抑菌圈直径，也可以用 游标卡尺进行测量直径。
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43
可整理ppt
44
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45
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46
8、超净工作台：
用于菌种的接种、传代和菌悬液的制备。 超净台应放在洁净工作间或半无菌室内。
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28
琼脂扩散法(管碟法）：
是使用固体培养基，在培养基凝固前，将试 验菌混进去，采用一定的方法，将含有抗生素的 物质与含菌的培养基表面接触。目前，国际上采 用将抗生素加入到特定的小钢管中，使小钢管中 的抗生素与培养基表面接触，此方法称为“管碟 法”。经过培养后，由于抗生素不断向培养基中 扩散，凡抑菌浓度能到达之处，试验菌不能生长， 从而形成透明的抑菌范围，此范围一般都呈圆形， 称为“抑菌圈”。
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12、标准品
标准品是指用于生物检定、抗生素或生化 药品中含量或者效价测定的标准物质，一 般以效价单位标示，标准品应由国家法定 的单位制备、标定和供应，一般常用的标 准品来源于中国兽医药品监察所和中国药 品生物制品检定所。
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52
三、管碟法操作步骤
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六、林可胺类 主要有盐酸林可霉素、盐酸吡利霉素等。
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10
七、多肽类
包括硫酸黏菌素、杆菌肽锌、亚甲基水 杨酸杆菌肽、恩拉霉素、维吉尼霉素、那 西肽等。
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11
八、多糖类 包括阿维拉霉素、黄霉素等。
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12
九、其他：
包括延胡索酸泰妙菌素、泰妙菌素、盐酸 沃尼妙林、赛地卡霉素等
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7、抑菌圈测定仪： 用于测定细菌所致抑菌圈直径，也可以用 游标卡尺进行测量直径。
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8、超净工作台：
用于菌种的接种、传代和菌悬液的制备。 超净台应放在洁净工作间或半无菌室内。
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28
琼脂扩散法(管碟法）：
是使用固体培养基，在培养基凝固前，将试 验菌混进去，采用一定的方法，将含有抗生素的 物质与含菌的培养基表面接触。目前，国际上采 用将抗生素加入到特定的小钢管中，使小钢管中 的抗生素与培养基表面接触，此方法称为“管碟 法”。经过培养后，由于抗生素不断向培养基中 扩散，凡抑菌浓度能到达之处，试验菌不能生长， 从而形成透明的抑菌范围，此范围一般都呈圆形， 称为“抑菌圈”。
微生物药敏实验及合理使用抗生素-PPT课件
细菌耐药机制 革兰氏染色阴性细菌耐药机制
革兰氏染色阳性细菌耐药机制
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阻碍细胞壁合成(阳性细菌)
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阻碍细胞壁合成(阴性细菌)
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阻碍细胞壁合成(阴性细菌)
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抗生素作用机制
阻碍细胞壁合成
β－内酰胺类药物
万古霉素
抑制蛋白质合成
大环内酯类 氯林可霉素,氯霉素(50S) 四环素,氨基糖苷类(30S)
干扰细菌DNA合成
抗生素微生物检定
、结果计算及判定
结果测定
• 有破圈或圈不圆整，应舍弃该碟。用抑菌圈测定仪测 量抑菌圈直径大小。
结果判定
（1）可靠性测验：即通过对剂间变异的分析，以测验标准品和供 试品的对数剂量与反应的关系是否显著偏离平行直线。要求直
线回归要非常显著（P<0.01），偏离平行不应显著（P>0.05）。
• 二剂量要求参与统计的碟数至少4个，那我们至少做6 个碟子，一般做8个。 • 枯草芽胞杆菌需65℃水浴煮30min。 • 培养基加菌的温度60-65℃。
• 加20mL底层，凝固后加5mL菌层，凝固干燥15min左右， 放置钢管，待钢管自然沉降15min后，按 SH→TH→SL→TL顺序滴加药液。 • 盖陶瓦盖，35-37℃培养16-18h。
（2）可信限：一般抗生素鉴定可信限要求小于5%，庆大霉素要求 小于7%。 以上两个条件符合此次试验结果可靠。
（3）试验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的 110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以
重试。
试验结果最好在估计 效价的98%-102%这 个范围。
四、实例
吉他霉素
• 第三步：100u/mL稀释到终浓度。
双碟的制备
• 按要求配制抗生素检定培养基并灭菌，注入培养皿底
20mL作为底层，凝固后加5mL菌层。
• 芽胞类菌悬液65℃煮30min。
• 加细菌时培养基的温度：芽胞类60-65℃，非芽胞类 48-50℃。
放置钢管、滴加药液
• 待菌层凝固干燥15min左右，放置钢管，钢管自然沉降 15min后，按照SH→TH→SL→TL 的顺序滴加药液。 • 滴加要快
• 磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钠（Na2HPO4*12H2O）
结果测定
• 有破圈或圈不圆整，应舍弃该碟。用抑菌圈测定仪测 量抑菌圈直径大小。
结果判定
（1）可靠性测验：即通过对剂间变异的分析，以测验标准品和供 试品的对数剂量与反应的关系是否显著偏离平行直线。要求直
线回归要非常显著（P<0.01），偏离平行不应显著（P>0.05）。
• 二剂量要求参与统计的碟数至少4个，那我们至少做6 个碟子，一般做8个。 • 枯草芽胞杆菌需65℃水浴煮30min。 • 培养基加菌的温度60-65℃。
• 加20mL底层，凝固后加5mL菌层，凝固干燥15min左右， 放置钢管，待钢管自然沉降15min后，按 SH→TH→SL→TL顺序滴加药液。 • 盖陶瓦盖，35-37℃培养16-18h。
（2）可信限：一般抗生素鉴定可信限要求小于5%，庆大霉素要求 小于7%。 以上两个条件符合此次试验结果可靠。
（3）试验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的 110%，则检验结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以
重试。
试验结果最好在估计 效价的98%-102%这 个范围。
四、实例
吉他霉素
• 第三步：100u/mL稀释到终浓度。
双碟的制备
• 按要求配制抗生素检定培养基并灭菌，注入培养皿底
20mL作为底层，凝固后加5mL菌层。
• 芽胞类菌悬液65℃煮30min。
• 加细菌时培养基的温度：芽胞类60-65℃，非芽胞类 48-50℃。
放置钢管、滴加药液
• 待菌层凝固干燥15min左右，放置钢管，钢管自然沉降 15min后，按照SH→TH→SL→TL 的顺序滴加药液。 • 滴加要快
• 磷酸盐缓冲液（pH7.0） 取磷酸氢二钠（Na2HPO4*12H2O）
【抗生素精品课件】抗生素微生物检定法
悬液 的制
方法
备
⑤供试品溶 液的制备
④标准品溶 液的制备
学习目标 复习提问
类别 实验菌 培养基 PH
链、卡 枯草芽胞杆 Ⅰ
7.8-
庆、红 菌
8.0
新课大纲 新课内容 本课小结
四、土 滕黄八叠球 Ⅱ 氯、林 菌
6.56.6
课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容
牛肉浸 酵母浸 出粉 1.5g 出粉3g 胨5g
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
三、管碟法
T2
S1
S2
T1
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
1.理论依据：
• 扩散现象：由球面扩散动力学公式表 示
• 相当于直线方程：y=bX+c • 抗生素总量的对数值与所形成抑菌圈
直径的大小呈直线关系，来测定抗生 素抗菌活性。
2.影响因素?
学习目标
Ⅰ超净工作台
复习提问 Ⅱ抑菌圈测量仪
新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
Ⅲ双碟 Ⅳ陶瓦盖 Ⅴ钢管
Ⅻ试验菌
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
• 管碟法分为三种方法 一剂量法又称 标准曲线法，常用于原料生产的过程 监控、中间体或半成品检验；二剂量 法是抗生素质量检验的常规方法；三 剂量法主要用于标准品的标定。中国 兽药典（2005年版）收载了二剂量法 和三剂量法。
学习目标 复习提问 新课大纲 新课内容 本课小结 课后习题
抗生素效价测定技术—抗生素效价微生物检定法
知识点3：浊度法
四、检定操作方法
（一）线性试验
除另有规定外，取适宜的大小厚度均匀的已灭菌试管，在各试验
管内精密加入含试验菌的液体培养基9. 0ml，再分别精密加入各浓
度的标准品溶液1.0ml，立即混匀，按随机区组分配将各管在规定
条件下培养至适宜测量的浊度值（通常约为4小时）。
知识点3：浊度法
（三）空白试验
线关系，可采用t检验。
4．测定结果的计算及可信限率估计。
5．实验计算所得效价低于估计效价的90%或高于估计效价的1 10%，则检验
结果仅作为初试，应调整供试品估计效价，予以重试。
知识点3：浊度法
6．原料药效价测定一般需双份样品，平行实验以便核对。对不符
合规定的样品应至少有2次符合规定的结果，才能发出报告。
供试品低剂量溶液
（即SH→TH→SL→TL）
6.测量抑菌圈 双碟透明度好，无破损和不透明现象；抑菌圈应圆满，无破
圈或圈不完整现象，否则应弃去该双碟。
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
技能点1：二剂量法操作规程
在恒温培养箱中培养至规定时间
技能点1：二剂量法操作规程
• 测量抑制圈
的污染，放双碟的台面应用水平仪调水平。
玻璃/塑料
平皿(d=90mm
h=16-17mm)
菌层
5ml
含菌培养基
底层
20ml
灭菌培养基
技能点1：二剂量法操作规程
制备底层
制备菌层
技能点1：二剂量法操作规程
4.放置钢管
5.滴碟、培养
毛细滴管（或滴管）滴碟
滴加顺序：按标准品高剂量溶液→供试品高剂量溶液→标准品低剂量溶液→
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▪ 时间：一般为16~18h
结果计算及判断
结果计算及判断
▪ 抑菌圈的测量以及结 果的可靠性检验及效 价测定
多功能微生物自动测量分析仪
结果可靠性分析
▪ 试品间（F1）：供试品的估计效价是 否合适。P＞0.05
▪ 回归（F2）：剂量反应关系是否成立。 P＜0.01
▪ 偏离平行（F3）：量反应直线的斜率 是否有显著差异。P＞0.05
▪ 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选 择性差，效价测定受其他成分的影响。
▪ 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺 作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使 样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的 剂量反应曲线偏离，无法测准妥布霉素的 含量。
抗生素微生物检定法分类
▪ 1.稀释法 ▪ 2.浊度法 ▪ 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） ▪ 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗
结果 ▪ 易于操作，比浊仪在线培养和测定，具有
客观、精密便于自动化操作的优点 ▪ 采用液体培养基，无扩散因素的影响，试
验的灵敏度高，结果的精密度和正确度都 较扩散法好
浊度法
▪ 缺点： ▪ 对试验仪器的性能及试验器具的要求较高，
如培养温度要求一致，比色管的清洁等 ▪ 任何影响液体培养基内微生物生长的因素都
抗生素药品的特点
▪ 纯度一般较化学药品低 ▪ 发酵类产品通常为多组分且活性组分易发
生变异 ▪ 稳定性一般较化学药品差 ▪ 结构较一般化学药品复杂
抗生素检测技术与方法
▪ 高效液相色谱法 ▪ 高效毛细管电泳法 ▪ 气相色谱法 ▪ 高分子杂质测定法 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 溶出度 ▪ 不溶性微粒 ▪ 澄清度 ▪ 溶液颜色
试验准备
底层的制
备
供试品、标准品溶液的制备
菌层的制备
加钢圈
滴加抗生
素溶液 培养 抑菌圈的测量
结果的可靠性检验及效价测定
管碟法的操作步骤
▪ 预试验 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、
使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的 抑菌圈直径应在16~17.5cm，二剂量法高 剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在 18~22cm，三剂量法中间剂量浓度标准品 溶液所致的抑菌圈直径在15~18cm。
▪ 琼脂球面扩散动力学 公式：
▪ 奠定了管碟法量反应 直线公式的基础
r2 = 4 D T ln M /H ln C ln 4D T
lgM= 1 r2lgC4DTH
9.21DT
抗生素微生物检定法的概况
▪ 微生物检定法的特点 ▪ 1.微生物检定法可直观、特异性地反映出抗生
素药品的抗菌活性，显示临床的特点；
▪ 剂间（F6）：不同浓度间的差异是否 显著。P＜0.01
▪ 碟间（F7）：同一浓度间差异是否显 著。 P＞0.05
结果计算及判断
▪ 重试判定
▪ 抑菌圈大小的要求
▪ 可靠性检验：符合可靠性检验的各项规定
▪ 可信限率：供试品效价测定结果（PT）的 可信限率除特殊规定外，不得大于5%。
▪ 实测效价与估计效价：应在90~110%之间， 否则结果仅作为初试，骤
▪ 培养基的制备
管碟法的操作步骤
▪ 底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
管碟法的操作步骤
▪ 加钢圈 ▪ 滴加抗生素溶液
培养
▪ 温度：一般为 36~37℃
生素的效价
抗生素微生物检定方法比较
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的 固体培养基内成球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖 而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一 定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径 （面积）呈直线关系而设计，通过检测抗 生素对微生物的抑制作用，比较标准品与 供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品 的效价。
▪ 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍 复试。
二剂量法计算
P=log1T T2 2 T S12ST21 S S1 1I100%
结果计算及判断
检定的影响因素
会影响抗生素效价的测定
管碟法
▪ 利用抗生素在固体培 养基中的平面扩散作 用，依据量反应平行 原理并采用交叉实验 设计方法。在相同的 试验条件下通过比较 标准品（已知效价） 和供试品两者对所接 种试验菌产生的抑菌 圈（直径或面积）的 大小来测定供试品效 价的一种方法
管碟法
▪ 管碟法的操作步骤
预试验
抗生素微生物检定法
定义：抗生素微生物检定法是利用抗生素在 低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的 特点，以微生物的抗菌活性为指标，来衡 量抗生素中的有效成分效力的方法。
方法：本法是在适宜的条件下，根据量反应 平行原理设计，通过检测抗生素对微生物 的一直作用，计算抗生素活性（效价）的 方法。
量反应平行原理
抗生素微生物检定法
*** ***药品检验所
抗生素检测技术专题研讨班概况
▪ 《中国药典》2010版抗生素检测技术与方法概述 ▪ 《中国药典》2010版抗生素有关物质检测 ▪ 残留溶剂测定法 ▪ 抗生素聚合物检查 ▪ 《中国药典》2010版抗生素溶出度方法介绍 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 《中国药典》2010版抗生素质量标准建立概述 ▪ 抗生素药品质量标准提高的价值与技术策略
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 比浊法：通过监测等量的试验菌菌液在不 同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况， 利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素 的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑 菌效力的发疯，可用于抗生素药物的含量 （效价）测定。
浊度法与管碟法方法比较
浊度法
▪ 优点： ▪ 速度快，试验过程3-4小时，可在当天获得
▪ 2.多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的 差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、 寒冷和活性的关系；
▪ 3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当 的分析方法测定其效价；
▪ 4.同时微生物法所需仪器设备简单，成本较低。
微生物检定法的局限性
▪ 本法测定的是有抑菌作用物质的总效价， 测定结果不能反映药品的纯度，不能排除 其他组分或活性杂质的干扰。
结果计算及判断
结果计算及判断
▪ 抑菌圈的测量以及结 果的可靠性检验及效 价测定
多功能微生物自动测量分析仪
结果可靠性分析
▪ 试品间（F1）：供试品的估计效价是 否合适。P＞0.05
▪ 回归（F2）：剂量反应关系是否成立。 P＜0.01
▪ 偏离平行（F3）：量反应直线的斜率 是否有显著差异。P＞0.05
▪ 对复方制剂产品的检验，微生物检定法选 择性差，效价测定受其他成分的影响。
▪ 如：妥布霉素滴眼液，配方中含苯扎溴胺 作为防腐剂，苯扎溴胺具有抑菌作用，使 样品的抑菌圈增大，导致标准品和样品的 剂量反应曲线偏离，无法测准妥布霉素的 含量。
抗生素微生物检定法分类
▪ 1.稀释法 ▪ 2.浊度法 ▪ 3.琼脂扩散法（管碟法和打孔法） ▪ 2010版药典采用管碟法和浊度法来测定抗
结果 ▪ 易于操作，比浊仪在线培养和测定，具有
客观、精密便于自动化操作的优点 ▪ 采用液体培养基，无扩散因素的影响，试
验的灵敏度高，结果的精密度和正确度都 较扩散法好
浊度法
▪ 缺点： ▪ 对试验仪器的性能及试验器具的要求较高，
如培养温度要求一致，比色管的清洁等 ▪ 任何影响液体培养基内微生物生长的因素都
抗生素药品的特点
▪ 纯度一般较化学药品低 ▪ 发酵类产品通常为多组分且活性组分易发
生变异 ▪ 稳定性一般较化学药品差 ▪ 结构较一般化学药品复杂
抗生素检测技术与方法
▪ 高效液相色谱法 ▪ 高效毛细管电泳法 ▪ 气相色谱法 ▪ 高分子杂质测定法 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 溶出度 ▪ 不溶性微粒 ▪ 澄清度 ▪ 溶液颜色
试验准备
底层的制
备
供试品、标准品溶液的制备
菌层的制备
加钢圈
滴加抗生
素溶液 培养 抑菌圈的测量
结果的可靠性检验及效价测定
管碟法的操作步骤
▪ 预试验 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、
使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑 菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的 抑菌圈直径应在16~17.5cm，二剂量法高 剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在 18~22cm，三剂量法中间剂量浓度标准品 溶液所致的抑菌圈直径在15~18cm。
▪ 琼脂球面扩散动力学 公式：
▪ 奠定了管碟法量反应 直线公式的基础
r2 = 4 D T ln M /H ln C ln 4D T
lgM= 1 r2lgC4DTH
9.21DT
抗生素微生物检定法的概况
▪ 微生物检定法的特点 ▪ 1.微生物检定法可直观、特异性地反映出抗生
素药品的抗菌活性，显示临床的特点；
▪ 剂间（F6）：不同浓度间的差异是否 显著。P＜0.01
▪ 碟间（F7）：同一浓度间差异是否显 著。 P＞0.05
结果计算及判断
▪ 重试判定
▪ 抑菌圈大小的要求
▪ 可靠性检验：符合可靠性检验的各项规定
▪ 可信限率：供试品效价测定结果（PT）的 可信限率除特殊规定外，不得大于5%。
▪ 实测效价与估计效价：应在90~110%之间， 否则结果仅作为初试，骤
▪ 培养基的制备
管碟法的操作步骤
▪ 底层的制备： 每碟加底层培养基20ml，
待培养基凝固后，盖上 陶瓦盖，置35~37℃培 养箱中，待用。 ▪ 菌层的制备： 加入约含1%浓度菌悬液的 培养基5ml作为菌层
管碟法的操作步骤
▪ 加钢圈 ▪ 滴加抗生素溶液
培养
▪ 温度：一般为 36~37℃
生素的效价
抗生素微生物检定方法比较
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的 固体培养基内成球面形扩散，形成含一定 浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖 而呈现出透明的抑菌圈。根据抗生素在一 定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径 （面积）呈直线关系而设计，通过检测抗 生素对微生物的抑制作用，比较标准品与 供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品 的效价。
▪ 效价测定结果不符合规定时，需换人加倍 复试。
二剂量法计算
P=log1T T2 2 T S12ST21 S S1 1I100%
结果计算及判断
检定的影响因素
会影响抗生素效价的测定
管碟法
▪ 利用抗生素在固体培 养基中的平面扩散作 用，依据量反应平行 原理并采用交叉实验 设计方法。在相同的 试验条件下通过比较 标准品（已知效价） 和供试品两者对所接 种试验菌产生的抑菌 圈（直径或面积）的 大小来测定供试品效 价的一种方法
管碟法
▪ 管碟法的操作步骤
预试验
抗生素微生物检定法
定义：抗生素微生物检定法是利用抗生素在 低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的 特点，以微生物的抗菌活性为指标，来衡 量抗生素中的有效成分效力的方法。
方法：本法是在适宜的条件下，根据量反应 平行原理设计，通过检测抗生素对微生物 的一直作用，计算抗生素活性（效价）的 方法。
量反应平行原理
抗生素微生物检定法
*** ***药品检验所
抗生素检测技术专题研讨班概况
▪ 《中国药典》2010版抗生素检测技术与方法概述 ▪ 《中国药典》2010版抗生素有关物质检测 ▪ 残留溶剂测定法 ▪ 抗生素聚合物检查 ▪ 《中国药典》2010版抗生素溶出度方法介绍 ▪ 抗生素微生物检定法 ▪ 《中国药典》2010版抗生素质量标准建立概述 ▪ 抗生素药品质量标准提高的价值与技术策略
抗生素微生物检定法 包括管碟法和浊度法
▪ 比浊法：通过监测等量的试验菌菌液在不 同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况， 利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素 的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑 菌效力的发疯，可用于抗生素药物的含量 （效价）测定。
浊度法与管碟法方法比较
浊度法
▪ 优点： ▪ 速度快，试验过程3-4小时，可在当天获得
▪ 2.多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的 差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、 寒冷和活性的关系；
▪ 3.许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当 的分析方法测定其效价；
▪ 4.同时微生物法所需仪器设备简单，成本较低。
微生物检定法的局限性
▪ 本法测定的是有抑菌作用物质的总效价， 测定结果不能反映药品的纯度，不能排除 其他组分或活性杂质的干扰。