目的基因导入受体细胞(2)PPT

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8 多聚物介导法
聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨 酸等都是细胞融合剂。它们可以使细胞膜 之间或使DNA与膜形成分子桥，促使相互 间的接触和粘连。
还可以引起膜表面电荷的紊乱，干扰细胞 间的识别，从而有利于细胞膜间的融合和 外源DNA进入原生质体。
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9 花粉管通导法
将外源DNA涂于授粉的枝头上，使DNA沿花 粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还 不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。
特点：获得的转化植株来自同一个转化的细胞
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⑷悬浮细胞共培养转化法 此方法类似于原生质体共培养转化法，主要差
别是首先建立悬浮细胞系。
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3 植物病毒介导的感染 目前，利用植物病毒载体转化植物细胞大致
有以下两种战略： ⑴植物细胞原生质体感染； ⑵植物组织感染 例：植物双生病毒，成熟的病毒呈双颗粒
状，每一颗粒中有一条不同的DNA单链。只有 A和B同处一个植物细胞中，才形成具有感染力 的病毒。
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③脱菌培养
原因：与农杆菌共培养后的外植体表面及浅层 组织中常常共生有大量农杆菌，对外植体的正常 生长会产生不利影响，必须进行脱菌培养以杀死 和抑制农杆菌的生长。
方法：是指把共培养后的外植体转移到含有抗 生素的培养基上继续培养生长的过程。
时间：需5-6次继代培养
抗生素：目前使用最多的是头孢霉素，浓度 500mg/L
期外植体，同时还要考虑其最佳感受态时期。 ③转化外植体易于组织培养，并有较强的再生能力。 ④应考虑外植体中易被转化的分生组织感受态细胞
所在的部位及其数量。
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1.2 农杆菌接种操作步骤
①外植体的农杆菌接种 将切成小块的外植体浸泡在制备好的农杆菌液 中，浸泡一段时间后，进行共培养。 注意：A 浸泡时间
农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴 性，能感染双子叶植物和裸子植物，对绝大多 数单子叶植物无侵染能力。
当植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类 物质，如乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，它们 是农杆菌识别敏感植物的信号分子。
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1.1 选择转化外植体应具备的条件
①优先考虑叶片、子叶、胚轴等作为外植体材料。 ②要注意外植体的年龄，应选择转化能力较强的幼
第一节 重组DNA分子导入植物细胞
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植物转基因方法有三类：
⑴载体介导的转化方法； 概念：将目的DNA插入到农杆菌的Ti质粒或病毒
的DNA上，随着载体质粒DNA的转移而转移。 农杆菌介导法 ⑵DNA直接转化法； 通过物理或化学的方法 ⑶种质系统法； 花粉管通道法、胚囊子房注射法
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1 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法
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④筛选培养 将外植体转移至筛选培养基上继续培养，筛选
出被转化的细胞，经再分化培养成再生植株。
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2 针对不同的外植体以及不同的转化目的而建 立多种转化方法
⑴叶盘转化法
⑵整体植株接种转化法
⑶原生质体共培养转化法
⑷悬浮细胞共培养转化法
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⑴ 叶盘转化法
无菌叶盘 接种 愈伤再生植株
选择
注意：A、要求叶子脱分化后能再 分化形成植株；
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4 基因枪法
又称微弹轰击法，是利用高速运行的金属颗粒 轰击细胞时能进入细胞内的现象，将包裹在金属 颗粒（钨或金颗粒）表面的外源DNA分子随之 带入细胞进行表达的基因转化方法。
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5 电击法 细胞膜的基本成分是磷脂双分子层，在适 当的外加电压作用下，细胞膜有可能被击 穿，但不会导致细胞致命的伤害，当移去 外加电压后，被转化子数与用于转化处理的受体细胞数 的比率表示。 首先通过菌液的OD值测定或细菌计数，计算
用于制备感受态细胞的受体菌总数。然后计算转 化子与受体菌的比率。
例子：4ml菌液有2×108个菌体 得到103个转化子
转化率： 103/(2×108)=5×10-6 含义：每个受体菌细胞被转化的概率5×10-6 。
超螺旋构象的载体质粒往往具有较高的转化率，经酶切连接
操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制
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6 显微注射法
利用显微注射仪，通过机械方法把外源 DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转化 方法。
此方法的植物样品主要有单细胞、原生质 体、分生组织和胚胎组织等多细胞结构。
关键是细胞的固定技术。
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7 激光微束法
此方法是利用直径很小，能量很高的激光 微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理。 在荧光显微镜下找出合适的细胞，然后用 激光光源替代荧光光源，聚焦后发出激光 微束脉冲，造成膜穿孔，处于细胞周围的 外源DNA分子随之进入细胞。
B 工程菌的浓度 通常采用较低的菌液OD值和较短的浸泡时间 来进行外植体的接种。
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②农杆菌与外植体的共培养 将接种农杆菌后的外植体培养在诱导愈伤组织
或不定芽固体分化培养基上。农杆菌附着、TDNA的转移及整合都在这个时期完成。
注意：不同物种、外植体种类和农杆菌菌株的 最佳共培养时间有所不同。
烟草叶片 2d 马铃薯块茎 2-4d
这一方法技术简单，一般易于掌握，且能避免 体细胞变异等问题，故有一定的应用前景。
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第二节 转化率及其影响因子
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1 转化率： 每微克载体DNA在最佳转化条件下进入
受体细胞的分子数。
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2 转化率的计算
表示方式： 一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子 数或质量的比率表示； 例子：1ng 1kb DNA 分子数 109个 得到1000个转化子 转化率：103/109=10-6 含义：106个DNA分子才能获得1个转化子。
B、应用的局限性。
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⑵ 整体植株接种转化法
在整体植株上造成创伤 接种（注射器注射） 愈伤再生植株 要求：一般采用无菌的种子实生苗或试管苗
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⑶原生质体共培养转化法
嫩叶制备原生质体 与含重组Ti质粒的农杆菌混合培养
（农杆菌：原生质体=100：1）
32h后，收集原生质体，加羧苄青霉素杀死农杆菌 3-4周，形成小愈伤组织，形成再生植株
或者说，要得到一个转化子，需要 2×105个受体菌细胞。
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3 影响转化率的因素
⑴载体DNA及目标DNA重组
①载体本身的性质
一般来说，小分子质量的质粒，转化率高；大质粒通常转
化率低，超过30kb的重组质粒很难进行转化。
②质粒与受体细胞的亲和性
亲和性强的质粒转化率高于亲和性弱的质粒。
③载体的空间构象