Southern Blot原理及实验方法
Southern blot
• ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥
实验步骤
六.杂交和洗膜
• 将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封 闭6小时。
• 倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。 • 回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶
液I中,室温洗2次,每次摇动5分钟。 • 再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面
16 μl 2 μl 2 μl
总体积
20 μl 总体积
20 μl
37℃保温1.5h。
实验步骤
二. 1％琼脂糖电泳
两组共用一块凝胶，共7个样
1.基因组DNA10 mg
组 2.酶切样品（1）
1
3.酶切样品（2）
4.阳性对照（pSV-c-myc重组质粒经BamH I 酶切 后的8.5 kb线性片段，10pg/ml, 10ml)
影响杂交的因素
4）杂交液的离子强度
低盐浓度时杂交率较低,随着盐浓度增加,杂交率增加(Na+ 的作用)
高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定,当进行序列不完 全同源的杂交时,必须维持杂交液与洗膜液中较高的盐 浓度;
5）非特异性杂交反应：预杂交的作用
杂交前封闭膜上非特异性杂交位点,减少其对探针的非特 异吸附
实验步骤
• 切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶 走滤纸与胶之间的气泡
实验步骤
• 再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不 能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气 泡
实验步骤
• 紧贴凝胶四周各放一张X光片
实验步骤
• 小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要 紧贴滤纸，但不能让滤纸移动
实验步骤
Hale Waihona Puke 1d检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）
southern bloting的操作步骤和要点
southern bloting的操作步骤和要点Southern blotting是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分离DNA序列。
它是通过将DNA样本进行电泳分离，然后转移到固体载体上，并通过与DNA 探针的特异性杂交来检测特定的DNA序列。
在这篇文章中，我们将一步一步解释Southern blotting的操作步骤和要点。
第一部分：准备工作在进行Southern blotting之前，需要进行一些准备工作。
首先，准备DNA样本。
可以从细胞中提取总DNA或特定的DNA片断。
其次，准备电泳和转移材料，例如琼脂糖凝胶、缓冲液和膜。
第二部分：DNA电泳1. 准备琼脂糖凝胶：制备琼脂糖溶液，将其煮沸溶解，然后冷却至50-60摄氏度。
将DNA样本混合物加入琼脂糖凝胶孔中。
2. 电泳操作：将琼脂糖凝胶平放在电泳槽中，然后将电泳缓冲液倒入槽中，直到液面完全覆盖凝胶。
添加DNA分子量标准在凝胶的一侧，以便测量目标DNA 片断的尺寸。
3. 进行电泳：将电泳槽接入电源，将电流设定为适当的电压和时间，使DNA 片断按照大小进行分离。
一般情况下，较小的片断迁移得更远。
第三部分：DNA转移1. 准备转移堆栈：准备一个转移堆栈，它由棉花垫、滤纸和膜组成。
在膜上放置一层滤纸。
2. 加盖堆栈：在琼脂糖凝胶上方放置转移堆栈，然后加上配重来确保平坦和稳定。
3. 转移：连接电泳槽和堆栈，并将电流通过凝胶和膜，使DNA转移到膜上。
这个过程可以持续几个小时甚至一夜。
第四部分：DNA固定和探针杂交1. 固定DNA：将转移后的膜浸泡在碱性溶液中，如NaOH，以使DNA固定在膜上。
2. 探针制备：制备与目标DNA序列互补的DNA探针。
探针可以由放射性同位素标记（如32P）或非放射性标记（如生物素或荧光标记）。
3. 探针杂交：将探针与膜一起孵育，使其与目标DNA序列特异性结合。
探针将与膜上的相应DNA序列形成互补配对。
第五部分：探针探测和可视化1. 探针探测：根据探针标记的类型，选择适当的方法来探测已杂交的探针。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA 转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
southern 印迹法
实验七Southern印迹法[目的]１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。
２．了解Southern印迹的意义。
[原理]Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。
这种方法最初是由Southern于1975年建立的。
方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。
它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。
即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。
以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。
然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。
[器材与试剂]一、器材1．电热真空干燥箱2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物二、材料电泳分离DNA的琼脂糖凝胶三、试剂1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液[实验步骤]注意：操作戴手套！1．凝胶处理:1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。
southern blot原理
southern blot原理
Southern Blotting 原理
Southern blotting 技术是由 Edwin M. Southern 在 1976 以
一种简单而有效的方法提出的，用于支持DNA含量的分析。
它最常被用于鉴定由多种DNA碱基构成的特定序列，以及鉴定和检测特定DNA 序列的存在、比较、分析及其分布。
它通过将DNA模板分离出来，再将DNA模板用聚合酶链反应(PCR)扩增以获得足够多的DNA模板，最后将经过扩增的DNA模板遇到一种特殊的处理，以使它与一张特殊的膜片或者膜片上的特定序列结合。
Southern blotting 包括以下几个步骤：1). 将DNA样本用双链酶将双链DNA分割成小的片段；2). 将分离出来的小DNA片段用一种特殊的方法分子印迹(molecular blotting)到一张特殊的膜片上；3). 将特定的标记物(比如特定的核酸或抗体)与经过分子印迹的DNA片
段结合；4). 将结合物暴露在感光材料上，从而将其结果显示出来。
Southern blotting 技术可以用于检测DNA片段的量、品种、分布、多样性及数量。
这种技术具有准确性高、特异性好、操作简单、检测效率高的优势。
Southern blotting 技术可以用于：1). 鉴定特定的DNA序列；
2). 鉴定DNA片段的长度；3). 检测突变；4). 检测某种重组；5). 筛选特定基因序列；6). 检测融合基因；7). 研究基因组学；8). 检测特定的核酸，如RNA、miRNA、siRNA等。
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Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法Southern Blot是分子生物学中一种常见的实验技术，用于检测DNA样品中特定DNA 序列的存在和数量。
它被广泛应用于基因克隆、基因组分析、基因诊断、DNA指纹鉴定和DNA进化研究等方面。
Southern Blot的基本原理是将DNA样品经过限制酶切后，在电泳中分离出目标DNA 片段。
然后将这些片段转移到固体媒介（通常是尼龙膜或硝酸纤维素纸）上，并固定在媒介上。
接下来，将一段标记有特定序列的探针加入到膜上，在一定条件下进行杂交反应。
探针与目标DNA片段互补结合，形成杂交带，从而检测出特定的DNA序列的存在。
1. DNA提取与限制酶切首先需要从目标样品中提取所需的DNA，并通过限制酶切，将DNA切割成特定长度的片段。
限制酶的选择应根据所需检测的DNA序列而定。
2. DNA电泳分离将限制酶切割后的DNA通过电泳进行分离，使用凝胶电泳对目标DNA进行分离，通常使用琼脂糖凝胶或封孔凝胶。
3. DNA转移将DNA片段转移到固体媒介（通常是尼龙膜或硝酸纤维素纸）上，将凝胶与固体媒介层间贴合，通过电流使DNA穿过凝胶，转移到固体媒介上。
4. 探针与杂交使用特定序列的探针，对膜上的目标DNA进行杂交。
探针需要标记上含有辨识探针的标记物，如放射性同位素或酶。
在一定条件下进行杂交反应，探针需要与目标DNA序列互补，形成稳定的结合。
5. 洗脱将未结合的杂交缓冲液和杂交条件下无法结合的DNA片段洗脱，保留与探针杂交的特定DNA带。
6. 分析结果可通过显色、荧光标记等方式对膜上的目标DNA进行检测。
检测结果通常以浓度及分子量的方式呈现。
Northern blot技术
核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
southern blotting原理和步骤
southern blotting原理和步骤嘿，咱今儿个就来唠唠 southern blotting 这档子事儿哈！你说 southern blotting 呀，那就像是一场分子世界里的奇妙探险！想象一下，我们就像一群好奇的探险家，要在那茫茫的分子海洋里找到我们想要的宝贝。
它的原理呢，其实挺有意思的。
简单来说，就是利用核酸分子杂交的特性，来检测特定的 DNA 片段。
就好像我们有一把专门的钥匙，能打开特定的那扇门。
这钥匙就是我们设计的探针，而那扇门就是我们要找的目标 DNA 呀！接下来讲讲步骤，这可真是个精细活儿！首先得把我们要研究的DNA 从细胞里提取出来，这就好比从一个大宝藏里把宝贝给挖出来。
然后呢，用限制性内切酶把这 DNA 切成一段段的，哎呀，这就像把一个大拼图给拆开了。
再之后，把这些切好的 DNA 片段通过电泳的方式，让它们在凝胶里排好队，这就像是让一群小朋友按高矮个站好一样。
接着，把这些排好队的 DNA 从凝胶里转移到膜上，这一步可关键啦，就像把宝贝从一个地方小心翼翼地搬到另一个地方。
然后呢，就是让我们的探针上场啦！这探针就像个机灵的小侦探，专门去寻找它的目标。
把膜和探针放在一起，让它们相互作用，就像两个好朋友见面聊天一样。
最后呀，通过一些检测手段，我们就能知道探针有没有找到它的目标啦！如果找到了，那就大功告成啦！你说这 southern blotting 是不是很神奇？它就像是在分子世界里搭建了一座桥，让我们能从茫茫的分子中找到我们想要的那一部分。
你想想，要是没有 southern blotting，我们怎么能这么准确地找到特定的 DNA 呢？它可是为我们打开了一扇了解基因的大门啊！所以说呀， southern blotting 虽然步骤有点多，有点复杂，但它的用处可大着呢！它就像一把神奇的钥匙，能帮我们解开很多基因的秘密。
咱可得好好记住 southern blotting 的原理和步骤，说不定啥时候就能派上大用场呢！是不是很有意思呀？哈哈！。
southern blot名词解释
southern blot名词解释
Southern blot是一种分子生物学技术，用于检测和分析DNA
序列的存在和数量。
它的名字来源于其开发者爱德华·南方（Edwin Southern）。
Southern blot技术利用DNA电泳、转移
与固定等步骤，将DNA在凝胶上进行分离，并通过杂交反应
检测特定序列。
首先，通过限制性内切酶将DNA剪切成片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳将DNA分离成不同大小的片段。
接
下来，将DNA片段转移至固体载体（通常是尼龙膜或硝酸纤
维膜），形成DNA的复制。
在杂交反应中，使用标记有特定
探针的DNA或RNA序列与蛋白酶K处理后的膜进行结合，
以检测特定序列的存在。
通过观察标记物的信号强度和位置，可以确定DNA序列的存在和数量。
Southern blot技术通常用
于检测DNA重组、基因突变、基因表达等各种研究中。
Southern_blot实验方法与步骤
实验名称： Southern blot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。
二、实验原理将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
三、试剂与仪器（一）器材：糖瓷盘，台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl）中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）,转印迹液SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0）标记探针，20×SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）2×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS)1×缓冲洗液（0.1M马来酸0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于]1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.51×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5）抗－地高辛－碱性磷酸酶。
四、实验步骤1、制备DNA分子（PCR）2.琼脂糖凝胶电泳分离DNA3电泳结束后，将胶小心从电泳槽中取出，用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪，然后将胶放入0.25 N HCl中脱嘌呤，当胶中的溴酚蓝变为黄色取出4将胶从HCl溶液中取出，用ddH2O涮洗两次，然后放入碱变性液（0.5 M NaOH）中处理45 min，使胶中的ds-DNA变为SS-DNA。
Southern blot实验报告
医学分子生物学实验技术实验报告实验名称： Southern blot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。
二、实验原理1. Southern blot实验原理根据DNA变性和复性发展的一种实验技术，就是分子杂交（hybridization)。
指两条来源不同但具有同源性的核酸单链在一定条件下，根据碱基互补的原则缔结成双链分子。
Southern杂交是指一种利用标记的探针与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
其主要步骤包括：⑴基因组DNA的限制性酶切；⑵DNA 酶切片段的电泳分离和转移；⑶杂交及检测。
三、实验步骤1、基因组DNA的限制性内切酶酶切1.1按如下方案进行基因组的酶切HL60基因组DNA 10 mg 5 ul10×Buffer E 2 ulEcoR I（10 u/ml） 2 ulddH20 11ul总体积 20 ul37℃保温1.5小时。
2、电泳分离2.1保温期间，浇一块凝胶板：称0.6g琼脂糖加60ml1xTAE，微波炉低火加热1分钟，让琼脂糖完全溶解，稍微冷却后，加6 ulGelRed，浇在封好的并已插上梳子的凝胶板上，移去气泡，室温放置40分钟以上。
2.2 DNA酶切后加1/5体积6x加样缓冲液。
2.3 取阳性对照10ul，含c-myc 4.7 kb线性片段300pg，加1/5体积6x加样缓冲液。
2.4取基因组DNA10ug，加ddH2O至10 ul，加1/5体积6x加样缓冲液。
同时去自己抽提的基因组DNA20ul，加1/5体积6x加样缓冲液。
2.5将凝胶放入电泳槽中，加入1xTAE，直到液面高出凝胶1mm，将以上各样品小心加入样品槽中，两组共用一块凝胶，共7个样，从左至右依次为：1未酶切自己基因组，2未酶切老师基因组，3 酶切老师基因组，4阳性对照（4.8kb线性c-myc），5酶切老师基因组，6未酶切老师基因组，7未酶切自己基因组。
Southern Blotting技术总结
Southern Blotting技术总结Southern Blotting溶液的配制：※、变性缓冲液1.5M NaCl 0.5M NaOH※、中和缓冲液1.5M NaCl 1.0 MTris•HCl Tris,HCl调pH8.0※、20×SSC 1L3.0 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠 pH7.0)※、2×SSC:0.3 M NaCl, 0.03 M 柠檬酸钠(pH7.0)※、洗膜液Ⅰ的配制： 2×SSC，0.1%SDS※、洗膜液Ⅱ的配制： 0.5×SSC，0.1%SDS※、Washing Buffer:0.1 M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5）,0.3%(V/V) Tween※、Maleic Acid Buffer：0.1M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5）※、1×Blocking Solution：10×Blocking Solution(vial6),用Maleic Acid Buffer稀释10倍（现配现用）；※、Antibody solution:每次使用前，4℃,10000rpm离心Anti-Digoxigenin-AP (vial 4) 5min，小心从表面吸取所需剂量，用1×Blocking Solution按1:5000 稀释Anti-Digoxigenin-AP，2-8℃可稳定保存12h.※、NBT/BCIP 用前37℃水浴溶解。
一、基因组DNA的制备要点：1、DNA纯度要高，最好有除去多聚糖的纯化步骤，如醋酸铵等。
2、DNA 完整性好；3、酶切体积要大：反应体积1ml，可分2个0.5ml离心管进行，每个离心管的DNA量至少25μg （尽量少留空气，防止蒸发，盐浓度增加）；4、两管的DNA量30—40μg，最高50μg；5、内切酶用量：按照说明加入内切酶，消化期间颠倒混匀，可于反应中间再加1-2μl酶量（总体积的1/10），消化时间：12小时左右。
Southern-Northern区别
Southern-Northern区别（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA 或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
DNA => 琼脂糖电泳 => 印迹转移 => 预杂交 => 杂交（变性探针） => 洗膜 => 放射自显影或显色（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
mRNA提取 => 甲醛变性电泳 => 印迹转移 => 预杂交 => 杂交（变性探针） => 洗膜 => 放射自显影或化学发光（三）二者异同Southern blot 是分析DNA的杂交技术，Northern blot是分析RNA的，而Western blot是分析蛋白质的Southern 和Northerin原理基本相同，都是利用DNA或RNA 的复性过程，但过程上也有区别，主要是Southern是先电泳后变性，而Northern是先变性后电泳；Southern是碱变性，而Northern采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性，因为采用碱变性会导致RNA水解（四）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法。
Southern-Blot-实验流程(包括原理细节)
Southern Blot 实验流程（包括原理/细节）一、DNA 的提取人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase 处理和纯化来提取DNA。
(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。
(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1% SDS)充分混匀，加入蛋白酶K 至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。
(3)50℃水浴2h，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DN A断裂，约3min。
12000r/min 离心15分钟（室温）(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质12000 r/min 离心15分钟（室温）(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀12000 r/min 离心15分钟（室温）(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时12000 r/min 离心15分钟（室温）(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。
(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K 至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入NaAC至终浓度10mmol/L。
(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。
(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃1小时。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。
Southern blot实验方法与步骤
•Southern blot实验方法与步骤用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。
用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。
将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。
利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。
（一）器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20�wSSC （3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针， 2�wSSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。
注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。
2、消化好的样品点样于0.7％琼脂糖凝胶进行电泳；注意：为保证DNA均匀分散于加样孔，应缓慢将样品加至加样孔。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复Southwestern blotting是一种生物化学实验技术，用于检测和确定在特定生物样品中的DNA结合蛋白质。
这项技术结合了Southern blotting 和Western blotting两种方法，在实验中使用了蛋白质和DNA结合的特性。
下面将逐步介绍这个实验的步骤。
第一步：制备样品和试剂首先，需要准备需要检测的生物样品，可以是细胞培养物、组织样本或纯化的蛋白质。
同时，还需要准备一系列试剂，包括缓冲液、酶、特异性探针和适当的抗体。
第二步：制备DNA探针DNA探针是用于检测特定的DNA序列的一种标记化DNA片段。
制备DNA探针的第一步是通过PCR扩增目标DNA序列。
在PCR反应中，选择特异性引物，使其与目标DNA序列互补。
然后，在PCR反应中加入dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、DNA聚合酶和缓冲液，进行多次的循环反应，以扩增目标DNA序列。
最后，通过各种纯化技术（如凝胶电泳和柱层析）从PCR反应混合物中纯化出DNA探针。
第三步：制备核酸和蛋白质混合物接下来，在准备样品中加入适当数量的DNA探针和蛋白质提取剂。
该提取剂将从样品中提取出核酸和蛋白质，以备后续的电泳和转印。
第四步：电泳分离和转移将核酸和蛋白质混合物分别加载到不同的凝胶槽中。
然后，进行电泳分离，将核酸分离到一个凝胶中，将蛋白质分离到另一个凝胶中。
经过一段时间的电泳分离后，核酸和蛋白质在凝胶中形成明确的带状和斑点。
接下来的步骤是将核酸和蛋白质从凝胶转移到固定膜上。
这个步骤被称为电转印。
它通常使用半湿式电转印系统，其中凝胶和固定膜在电场中进行转移。
经过一段时间后，核酸和蛋白质都会迁移到固定膜上。
第五步：固定和杂交将固定在膜上的核酸和蛋白质用适当的试剂进行固定，通常使用甲醛或紫外线进行固定。
然后，用特异性探针与固定膜上的核酸进行杂交。
探针是标记有放射性荧光或酶的DNA片段，在杂交过程中与目标DNA结合。
Southern_Blot分析课件
10min
20min 20min
中和
准备材料：
尼龙膜、滤纸、吸水纸 * 大小与胶等同 * 平衡于20×SSC
500g
搭置装置： * 叠放顺序 * 逐层赶气泡 * 避免短路
20×SSC
装置图 转 移 方 向
吸水纸
滤纸 尼龙膜 凝胶 盐桥
引物标记
标记物：地高辛 ( DIG – dUTP ) 标记法：随机引物法
DNA转移
原理：利用毛细管虹吸作用，将分离的DNA片段 从琼脂糖凝胶中转移至固体支持膜上。 方法：准备材料
凝胶处理
搭置装置
Hale Waihona Puke 凝胶处理：处理 酸处理 碱处理 盐处理 溶液 0.25mol / L HCl 0. 5mol / L NaOH 1. 5mol / L NaCl 1mol / L Tris-Cl ( pH7.4 ) 1. 5mol / L NaCl 时间 作用 脱嘌呤 变性
DNA的检测
• 用溴乙锭染色 • 在254nm紫外光下检测，如需回收最好在 300nm紫外光下割胶，否则易脱嘌呤而断 链，在1cm宽带上可检到10ng DNA。
分 析
• 通常与已知分子量的标准DNA片段一起电泳， 经比较可获知DNA标本大小。如条带拖尾， 系加入DNA量太多或凝胶未制好。如分子量 小或一片糊状，表示DNA有降解。
电泳 * 2 ~ 5 V/cm * 注意正、负极
琼脂糖浓度 迁移率与浓度成反比
• 琼脂糖含量％（W/V） 线性DNA分离范围（Kb） • 0.3 5 - 60 • 0.6 1 - 20 • 0.7 0.8 - 10 • 0.9 0.5 - 7 • 1.2 0.4 - 6 • 1.5 0.2 – 3 • 2.0 0.1 – 2
southern blot法 -回复
southern blot法-回复什么是Southern Blot法？Southern Blot法是一种分子生物学技术，用于检测和分离DNA序列。
它是由埃德蒙·南方（Edmund M. Southern）于1975年开发的，因此得名。
该技术被广泛用于确定DNA样本中特定基因序列的存在及其相对丰度。
为何需要Southern Blot法？Southern Blot法的主要目的是帮助研究者确定DNA样本中特定序列的存在与否。
这在基因组学、遗传学和疾病研究等领域至关重要。
通过Southern Blot法，研究者能够分离DNA样本中特定的序列，并进行进一步的分析和研究。
Southern Blot法的步骤：1. DNA提取：首先，从待测样本（细胞、组织等）中提取DNA。
这个步骤可以使用已有的DNA提取方法，如酚-氯仿提取法，盐法提取法等。
2. DNA切割：提取的DNA通常是整个基因组的混合物。
为了特定序列的检测，需要使用特定酶来切割DNA，形成DNA片段。
这些酶通常是限制性内切酶，根据目标DNA序列的长度和特点而选择。
3. 凝胶电泳：将DNA片段按大小在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
由于DNA带电性质，电场会将DNA片段推动向正极。
较小的DNA片段会通过凝胶的细孔迁移得更远，而较大的DNA片段会迁移得更慢。
4. DNA溶解和转移：凝胶上的DNA片段在电泳后需要转移到膜上便于后续的探针杂交。
为此，凝胶需要溶解并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上。
5. 杂交：为了探测目标序列，需要制备一个与目标DNA序列互补的探针。
探针通常是通过DNA合成或PCR技术制备的标记有特定标签（如放射性同位素、荧光标记、生物素等）的DNA片段。
这个探针与转移到膜上的DNA片段进行杂交，形成互补配对。
6. 探针检测：探针与目标DNA序列结合后，需要对其进行检测。
如果探针上带有放射性同位素标签，可以使用放射自显影来观察结果。
其他标签则可以使用相关荧光或酶的底物进行检测。
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Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
先把它放在去离子水中润湿后，再放在20倍SSC溶液中润湿5分钟，然后放在凝胶表面，两层之间不可有气泡。
7. 然后再把两张与滤膜一样大小的二号滤纸，在2倍SSC溶液中浸湿，覆盖在硝酸纤维膜上，同样要把气泡赶走。
8. 把一叠吸水纸（或卫生纸，约有5—8cm高，略小于滤纸），放置在滤纸上，在吸水纸上再放一块玻璃板和重约500g的重物，放置过夜。
9.转移结束后，移去上面的吸水纸和滤纸，同时翻转取出凝胶与硝酸纤维膜，把凝胶的点样与硝酸纤维膜的相对应位置用铅笔或解剖针的针尖做好标记。
11. 把已转移了DNA的硝酸纤维膜放在6倍SSC溶液中振荡浸泡5分钟，然后放在滤纸上吸干溶液。
再把它夹在两层滤纸之间，80℃真空干燥2小时。
注意事项（1）将凝胶中和至中性时，要测pH, 防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
(2) 要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。
SDS-PAGE实验原理及注意事项SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber 和Osborn进一步完善。
一、原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。
本实验采用垂直板状不连续系统。
所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。
1．样品的浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。
在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。
这些离子在电泳时都向正极移动。
C1—速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。
由于C1—很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。
2．分子筛效应蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。
由于其pH 升高(电泳进行时常超过9.0)，使Gly 解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。
此两项变化，使Gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。
分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。
二、注意事项1. SDS 与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g 蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS 结合量不足。
2. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。
不能利用这次的标准曲线作为下次用。
并且SDS-PAGE 测定分子量有10％误差，不可完全信任。
3. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS 的作用下解离成亚基或多条单肽链。
因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。
4. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。
5. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS 不纯引起。
印迹法（blotting ）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern 建立了将DNA 转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA －RNA 杂交检测特定的DNA 片段的方法，称为Southern 印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA 和蛋白质进行印迹分析，对RNA 的印迹分析称为Northern 印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern 印迹法Western Blot 基本原理：在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测一般流程：SDS-PAGE 原理：SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交底物显色每单位重量之蛋白质带电价一致(charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素Western Blot常见问题分析***SDS-PAGE电泳：1、胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐2、条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。
同时注意电泳槽装置是否合适***转膜及抗体检测：1、凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。
可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。
转膜过程注意降温***背景太高原因：1、膜没有均匀浸湿2、膜或者缓冲液污染3、封闭不充分4、抗体与封闭剂出现交叉反应5、抗体浓度过高对策：1.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度。