第4章 工业微生物学基本实验技术

本文由ｓｉｆａｎｈｕ贡献 ｐｐｔ文档可能在ＷＡＰ端浏览体验不佳。建议您优先选择ＴＸＴ，或下载源文件到本机 查看。 第４章 工业微生物学基本实验技术 章 第一节 工业微生物的制片与显微技术 一、工业微生物显微标本片制作技术 二、显微技术 第二节 工业微生物的纯培养技术 一、培养基的配制与灭菌技术 二、无菌操作技术 三、工业微生物分离与纯化技 术 四、厌氧微生物纯培养技术 １． 真空干燥器化学吸氧法 ２． 厌氧罐培养法 ３． 厌氧 手套箱培养法 ４． Ｈｕｎｇａｔｅ滚管法 滚管法 五、工业微生物大规模培养技术 ——机械搅拌通风发酵 原料 仓库 菌种 种子罐 原料制备 和预处理 筛选 粉碎 消毒 发酵罐 产物回收 产品 废物 空气 压缩 除菌 工业发酵流程示意图 （二）发酵罐的类型 １．按微生物生长代谢需要分类： ．按微生物生长代谢需要分类： 好气：抗生素、酶制剂、酵母、氨基酸， 好气：抗生素、酶制剂、酵母、氨基 酸，维生素 等产品是在好气发酵罐中进行的； 等产品是在好气发酵罐中进行的；需 要强烈的通 风搅拌，目的是提高氧在发酵液中的传质系数； 风搅拌，目的是提高氧 在发酵液中的传质系数； 厌气：丙酮丁醇、酒精、啤酒、乳酸等采用厌气 厌气： 丙 酮丁醇、 酒精、 啤酒、 发酵罐。不需要通气。 发酵罐。不需要通气。 ２． 按照发酵罐设备特点分类： 按照发酵罐设备特点分类： 机械搅拌通风发酵罐：包括循环式， 机械搅拌通风发酵罐：包括循环式，如伍 式发 酵罐，文氏管发酵罐， 酵罐，文氏管发酵罐，以及非循环式的通风式 发酵罐和 自吸式发酵罐等。 发酵罐和自吸式发酵罐等。 非机械搅拌通风发酵罐：包括循环式 的气提式、 非机械搅拌通风发酵罐：包括循环式的气提式、 液提式发酵罐， 液提式 发酵罐，以及非循环式的排管式和喷射 式发酵罐。 式发酵罐。 这两类发酵罐是采用 不同的手段使发酵罐内的 液三相充分混合， 气、固、液三相充分混合，从而满足微 生物生 长和产物形成对氧的需求。 长和产物形成对氧的需求。 ３．按容积分类： ．按容积分类： 实验室发酵罐： ～ 实验室发酵罐：５～１００Ｌ； ； 中试发酵罐： 中试发酵罐： ５０－１００００Ｌ； ； 生产规模的发酵罐： 以上。 生产规模的发酵罐： ５０００Ｌ以上。 以 上 啤酒发酵罐 （三）发酵罐的基本要求 径高比。 （ １） 发酵罐应具有适宜的 径高比 。 罐身越高 ， ） 发酵罐应具 有适宜的径高比 罐身越高， 氧的利用率较高。 氧的利用率较高。 压力。 （２）发 酵罐能承受一定的压力。 ）发酵罐能承受一定的压力 溶解氧。 （３）要保证发酵液 必须的溶解氧。 ）要保证发酵液必须的溶解氧 冷却面积。 （４）发酵罐应具有足够 的冷却面积。 ）发酵罐应具有足够的冷却面积 死角， （ ５） 发酵罐内应尽量减少 死角 ， 避免藏垢积 ） 发酵罐内应尽量减少死角 灭菌能彻底 避免染菌。 能彻底 ， 污，灭菌能彻底，避免染菌。 轴封应严密， （６）搅拌器的轴封应严密，尽量减 少泄漏。 ）搅拌器的轴封应严密 尽量减少泄漏。 （四）通用式发酵罐的结构 １、罐体 、 ２、搅拌器 、 ３、挡板 、 ４、消泡器 、 ５、空气分布装置 、 ６、
ｐａｇቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ２
发酵罐装料容积 一般情况下，取罐圆柱部分高度的 ％： 一般情况下，取罐圆柱部分高度的７０％ ： 极少泡沫时为８０％； 极少泡沫时为 ％； 易起泡时为６０％。 易起泡时为 ％。 ５． 空气分布装置 空气分布装置的作用是吹入无菌空气， 空气分布装置的作用是吹入无菌空气， 并 使空气均匀分布。 使空气均匀分布。 单孔管：管口对正罐底中央， 单孔管：管 口对正罐底中央，装于最低一 挡搅拌器下面，管口与罐低的距离约４０ｍｍ。 挡搅拌器 下面，管口与罐低的距离约 。 环形管： 环形管：带有小孔的环形空气分布管 ６． 冷却装置 ５ｍ３以下发酵罐一般采用夹套冷却。 以下发酵罐一般采用夹套冷却。 大型发酵 罐采用列管冷却（四至八组）。 大型发酵罐采用列管冷却（四至八组）。 夹套内设 置螺旋片导板，来增加换热效果，同 夹套内设置螺旋片导板，来增加换热效果， 时 对罐身起加强作用。 时对罐身起加强作用。冷却列管极易腐蚀或磨 损穿孔，最好用 不锈钢制造。 损穿孔，最好用不锈钢制造。 ７． 联轴器及轴承 大型发酵罐搅拌轴较长，常分为二至三段， 大型发酵罐搅拌轴较长，常分为二 至三段，用联轴器 使上下搅拌轴成牢固的刚性联接。 使上下搅拌轴成牢固的刚性联 接。 为了减少震动，中型发酵罐一般在罐内装有底轴承， 为了减少震动，中型发酵 罐一般在罐内装有底轴承， 而大型发酵罐装有中间轴承。 而大型发酵罐装有中间轴 承。 罐内轴承不能加润滑油，应采用液体润滑的塑料轴瓦 罐内轴承不能加润滑油， 如石棉酚醛塑料，聚四氟乙烯等）。 （如石棉酚醛塑料，聚四氟乙烯等）。 罐内轴 承接触处的轴颈极易磨损， 罐内轴承接触处的轴颈极易磨损，尤其是底轴承处的 磨 损更为严重， 磨损更为严重，可以在与轴承接触处的轴上增加一个 轴套，用紧固螺 钉与轴固定， 轴套，用紧固螺钉与轴固定，这样仅磨损轴套而轴不 会磨损，检修时 只要更换轴套就可以了。 会磨损，检修时只要更换轴套就可以了。 ８． 轴 封 轴封的作用： 轴封的作用：使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加 以密封，防止泄露 和污染杂菌。 以密封，防止泄露和污染杂菌。常用的轴封有 填料函轴封和端面轴封 两种。 填料函轴封和端面轴封两种。 １０． 清洗装置 发酵罐的容量正在逐步增大， 发酵罐的容量正在逐步增大 ， 这类发酵 罐大部 分安装在室外， 罐大部分安装在室外 ， 原来的清洗方法 已不适用， 必须采用自动 化的喷洗装置。 已不适用 ， 必须采用自动化的喷洗装置 。 采 用 较 多 的 是 Ｃ ＩＰ 清 洗 系 统 （ ｃｌｅａｎ ｉｎ ｐｌａｃｅ ），意即内部清洗系统。 意即内部清洗系统。
ｐａｇｅ ３
不分泌淀粉酶 滴加 碘液 培养基中含有淀粉 分泌淀粉酶 ３． 脂肪水解试验 中性红 阴性 产脂肪酶 二、微生物对氮源的利用试验 １． 明 胶 液 化 试 验 ２． 石蕊牛奶试验 牛奶主要含有乳糖和 牛奶主要含有乳糖和酪蛋白 乳糖 石蕊牛奶 发酵乳糖产酸 产蛋白酶 ３．尿素分解试验 尿素分解试验 ｐＨ６．８ ｐＨ８．４ 尿素酶（脲酶）分解尿素产生氨， 尿素酶（脲酶）分解尿素产生氨，当ｐＨ＞８．４ 时 时 酚红指示剂显深粉红色。 酚红指示剂显深粉红色。 ４． 硝酸盐还原试验 格里斯 — 试剂 ＮＯ３— ＮＯ２ 溶液呈粉红色 溶液不呈蓝色 ＮＨ３、Ｎ２ 二苯胺 试剂 第四节 工业微生物的检测技术 一、工业微生物数量的测定 显微直接计数法 平板菌落计数法 光电比浊法 二、 食品卫生的微生物学检测——大肠菌 食品卫生的微生物学检测 大肠菌 群数的测定 饮用水的微生物学标准 细菌总数≤１００ 个／ｍｌ 细菌总数 大肠菌群数≤３个 大肠菌群数 个／１０００ｍｌ 大 肠菌群（ｃｏｌｉｆｏｒｍｓ） 大肠菌群 指任何可发酵乳糖产酸产气的Ｇ—、杆状、无芽 杆状、 指任何可发酵乳糖产酸 产气的 兼性厌氧的肠道细菌，典型代表是Ｅ．ｃｏｌｉ，也包 孢、兼性厌氧的肠道细菌， 典型代表是 ， 括Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（产气肠杆菌）、 （产气肠杆菌） ｃｉｔｒ ｏｂａｃｔｅｒ（柠檬酸杆菌属）和Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ （柠檬酸杆菌属） ｐｅｎｕｍｏｎｉａｅ（肺炎克氏杆 菌）等。 （肺炎克氏杆菌） 水中大肠菌群数的测定 分三步进行） 发酵法 （分三步进行） ①初步发酵试验 单倍乳糖蛋白胨培养基、三倍浓乳糖蛋白胨培养基 单倍乳糖蛋白胨培养基、 乳 糖蛋白胨培养基 ②平板分离 品红亚硫酸钠培养基、伊红美蓝培养基， 品红亚硫酸钠培养基、伊红美蓝培养 基，革兰氏染色 ③复发酵试验 单倍乳糖蛋白胨培养基 滤膜法 三、噬菌体的检查及效价测定 效价（ｔｉｔｒｅ，ｔｉｔｅｒ）：这里指每毫升试样中所 效价（ ， ） 这里指每毫升试 样中所 含有的具侵染性的噬菌体粒子数，又称噬菌斑 含有的具侵染性的噬菌体粒子 数，又称噬菌斑 形成单位数（ｐｌａｑｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ，ｐｆｕ）或感染 形成单位数 ， 或 中心数（ ）。测定效价的方法 中心数（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｃｅｎｔｒｅ）。测定效价的方法 ）
ｐａｇｅ １
冷却装置 、 ７、联轴器及轴承 、 ８、轴封 、 ９、变速装置 、 １０、 １０、清洗装置
１． 罐体 由圆柱体及椭圆形或碟形封头焊接而成， 罐体 ：由圆柱体及椭圆形或碟形封头 焊接而成， 材料为碳钢或不锈钢， 材料为碳钢或不锈钢，对于大型发酵罐可用衬 不 锈钢板或复合不锈钢制成， 不锈钢板或复合不锈钢制成，衬里用的不锈钢 板厚为２－ ３毫米 毫米。 板厚为 毫米。 为了满足工业要求，在一定压力下操作、 为了满足工 业要求，在一定压力下操作、空消 或实消，罐为一个受压容器， 或实消，罐为一个 受压容器，通常灭菌的压力 公斤／厘米 绝对压力）。 为２．５公斤 厘米２（绝对压力） 。 公斤 标准发酵罐的几何尺寸 Ｈ／Ｄ＝１．７￣４ ｄ／Ｄ＝１／３￣１／２ Ｗ／Ｄ＝１／１２￣１／８ Ｂ／Ｄ＝０．８￣１．０ （ｓ／ｄ）２＝１．５￣２．５ （ｓ／ｄ）３＝ １￣２ ２． 搅拌器 搅拌器有平叶式、弯叶式、 搅拌器有平叶式、弯叶式、箭叶式三种 其作用是打 碎气泡，使氧溶解于醪液中， 其作用是打碎气泡，使氧溶解于醪液中，从搅 打碎气 泡 拌程度来说，以平叶涡轮最为激烈， 拌程度来说，以平叶涡轮最为激烈，功率消 耗 也最大，弯叶次之，箭叶最小。 也最大，弯叶次之，箭叶最小。 ３． 挡 板 挡板的作用是改变液流的方向， 挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为 轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。 轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解 氧。 通常挡板宽度取（ 通常挡板宽度取（０．１－０．１２）Ｄ，装设 块即 ） ，装设４－６块 即 可满足全挡板条件。 可满足全挡板条件。 所谓“全挡板条件”是指在一定转速下 ，再增 所谓“全挡板条件”是指在一定转速下， 在一定转速下 加罐内附件，搅拌功 率仍保持不变， 加罐内附件，搅拌功率仍保持不变，而旋涡基 本消失，一般满足下 式要求： 本消失，一般满足下式要求： Ｗ Ｚ ＝ ０．４ Ｄ Ｗ—挡板宽度， Ｄ—罐的直径， Ｚ—挡板数 挡板宽度， 罐的直径， 挡板宽度 罐的直径 挡板数 Ｗ ×Ｚ＝０．４ ＝ Ｄ 竖立的列管，排管， 竖立的列管，排管， 也可以起挡板作用， 也可以起挡板 作用， 故一般具有冷却列管 或排管的发酵罐内不 另设挡板。 另设挡板。 挡板的长 度自液面起到罐底为止。 挡板的长度自液面起到罐底为止。 挡板与罐壁之间的距离 为（ 挡板与罐壁之间的距离为（１／５￣１／９）Ｗ，避免 ） ， 形成死角，防止物料与菌 体堆积。 形成死角，防止物料与菌体堆积 ４． 消泡装置 消泡方式有两种：一是化学消泡 化学消泡， 消泡方式有两种 ： 一是 化学消 泡 ， 但高浓度的 化学消泡剂会对发酵产生抑制作用， 化学消泡剂会对发酵产生抑 制作用 ， 故不能添 加太多；二是机械消泡 机械消泡。 加太多；二是机械消泡。 锯齿式消泡桨． 它安装于罐内顶部、 ① 锯齿式消泡桨 ． 它安装于罐内顶部 、 高 出液 面的位置， 固定在搅拌轴上， 随搅拌轴转动， 面的位置 ， 固定在搅拌轴上 ， 随搅拌轴转动 ， 不断将泡沫打破。 不断将泡沫打破。 半封闭式涡轮消泡器， ② 半封闭式涡轮消泡器 ， 它是由前者发展改进 而来， 而来 ， 泡沫可直接被涡 轮打碎或被涡轮抛出撞 击到罐壁而破碎。 击到罐壁而破碎。 离心式消泡器，它们置于发酵罐的顶部， ③离心式消泡器，它们置于发酵罐的 顶部，利 用高速旋转产生的离心力将泡沫破碎， 用高速旋转产生的离心力将泡沫破 碎，液体仍 然返回罐内。 然返回罐内。 刮板式消泡器，它安装于发酵罐的排气口处 ， ④刮板式消泡器，它安装于发酵罐的排气口处， 泡沫从气液进口进到高速旋转的 刮板中， 泡沫从气液进口进到高速旋转的刮板中，刮板 转速为１０００—１４５０ ｒｐｍ，泡 沫迅速被打碎，由 转速为 ，泡沫迅速被打碎， 于离心力作用，液体披甩向壳体壁上 ， 于离心力作用，液体披甩向壳体壁上，返回罐 气体则由汽孔排出。 内，气体则由 汽孔排出。
六、空气除菌流程和设备 空气预过滤 空气压缩机 冷却器 析水器 加热器 空气贮罐 空气过滤器 发酵罐 。 发酵罐。 空气过滤除菌设备流程 粗过滤 空压机 储罐 二级冷却 加热器 空气过滤 旋风分离器 丝网分离器 两级冷却析水、 两级冷却析水、加热过滤除菌流程 第三节 工业微生物的生理与发酵试验技术 一、微生物对碳源的利用试验 １． 细菌的糖类发酵试验 ｐＨ５．２ ｐＨ６．８ 溴甲 酚紫 阴性 产酸 产酸 产气 ２． 淀粉水解试验