常见的实验室染色

五彩缤纷的世界

常见的染色简介

长治市第二人民医院

检验科:薛彬彬

未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

革兰氏染色抗酸染色墨汁染色瑞氏染色

革兰氏染色:

革兰氏染色是用来鉴别细菌的一种方法，利用细菌细胞壁上的主要成份不同，这种染色法，可将细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌。

这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（Hans Christian Gram，1853年－1938年）于1884年所发明，最初用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。

原理:

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物.

革兰氏阳性菌:

由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色.

革兰氏阴性菌:

因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

试剂：

龙胆紫、碘液、酒精、沙黄.

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤.

•媒染剂

•其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。

•脱色剂

•帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。

•复染液

•也是一种碱性染料，目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。

具体操作方法是：

1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker 笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

2、涂片：

液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。

3、晾干：

让涂片在空气中自然干燥。

4、固定：

让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。

固定的目的

•①杀死微生物，固定其细胞结构；

•②保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉；

•③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。

5、染色：

将固定过的涂片放架子上，滴加龙胆紫染液，染1min。

6、水洗：

用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。

7、媒染：

滴加1滴碘液，染1min，水洗。

8、脱色：

吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。

9、复染：

滴加沙黄复红复染1min，水洗。至此，革兰氏染色结束。

革兰氏染色

龙胆紫

碘液酒

精

沙黄水冲水冲水冲

染色结果

革兰氏阳性菌都呈蓝紫色，革兰氏阴性菌都呈粉红色。

临床意义

其重要的临床意义在于：

1.鉴别细菌

2.选择药物

3.与致病性有关：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素；而内毒素主要是指革兰氏阴性菌胞壁成分中的脂多糖，两者的致病作用不同。

注意事项

•1.革兰氏染色成败是脱色时间，如脱色过度阳性菌会被误认为为阴性菌；相反，时间过短，阴性菌又会被误认为阳性菌。所以一定要严格把握时间。

•2.选用18-24小时的菌龄的细菌为宜。若菌体过老，由于菌体死亡或自溶常使阳性菌转为阴性菌。

瑞氏染色:

瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlem blue ）和酸性染料黄色伊红（Eostm Y ）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝－伊红Y）染料。

观察内容

•红细胞

•白细胞

•血小板

原理

•瑞氏试剂中之酸性伊红和碱性美篮混合经化学作用后，变成中性之伊红化美蓝，久置后，经

氧化而含有天青。此三种染料分别和细胞核及浆

中的NH3+和COO-等结合，使细胞核及胞浆着色。由于系中性染料，又有缓冲液调节酸碱度，所以

细胞受染后，蓝红等颜色都较适中，核染质、胞

浆及其中之颗粒显色较为清楚。

•

各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质

中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质,原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。

具体操作方法是：

1、取标本推片、自然干燥

2、滴加瑞氏染液染1分钟,使标本被其中甲醛所固定;

3、加等量PH6.4的磷酸盐缓冲液(或等量超纯水)轻轻晃动玻片,均匀静置15分钟;