植物组织内可溶性蛋白质的提取和含量测定

植物组织中可溶性蛋白质含量的测定（福林－酚试剂法）

一、原理

福林（Folin）－酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质－铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定（范围为5～100μg蛋白质）。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：各种植物材料

（二）仪器设备：1. 722分光光度计；2. 离心机；3. 恒温水浴；4. 定量加样器；5. 冷凝回流装置一套；6. 研钵；7. 离心管；8. 刻度移液管；9. 微量滴定管；10. 试管等；

（三）试剂：标准蛋白质溶液：称取25mg牛血清蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使终浓度为250μg／ml；试剂甲；试剂乙。

三、实验步骤

（一）标准曲线的绘制

1. 取18×200mm试管7支，1～7编号，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1ml，使每管含蛋白量分别为0、25、50、100、150、200、250μg／ml。

2. 用定量加样器给每支试管中加入5ml甲液，混匀，于30℃下放置10min。

3. 再向试管中喷射加入0.5ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下准确保温30min。

4. 以不加标准蛋白的1号管为空白，在650nm下用1cm光径的比色皿测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（二）样品的测定

称取鲜样0.8g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，定容25ml过滤，取滤液1.0ml于试管中，然后重复标准曲线绘制中的2～4步骤，以空白管调零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。

四、结果计算：

样品中蛋白的含量（mg/g）＝C×V T/（V s×FW×1000）

式中：C－查标准曲线值（μg）；VT－提取液总体积（ml）；FW－样品鲜重（g）；Vs－测定时加样量（ml）

粗蛋白量（％）＝蛋白氮含量×6.2