拟南芥突变体鉴定 GT line genotypingSM.435

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拟南芥发育异常突变体的基因克隆与表型分析

拟南芥发育异常突变体的基因克隆与表型分析摘要植物发育在器官、组织和细胞等不同层次上受到复杂的遗传互作网络调控。

本实验室的研究方向是利用正向遗传学方法探索植物非生物逆境响应相关发育性状形成的遗传基础和分子机制。

实验室在前期工作中，在激活标签突变体库中筛选获得一个拟南芥显性突变体abs3-1D(abnormal shoot3-1 dominant)。

abs3-1D突变体呈现株型小，叶柄短，叶片紧凑，颜色偏黄，开花明显提前，次生花序簇生，主花序茎矮化，短角果且种子的育性下降。

在黑暗诱导条件下，abs3-1D表现出叶片衰老加速的特征。

为进一步研究ABS3在植物发育过程的功能，以abs3-1D为遗传背景进行EMS(乙基磺酸甲酯, ethyl-methane sulphonate)诱变。

在诱变体库中筛选到能够逆转abs3-1D早花表型的突变体F08-69。

F08-69表现出晚花表型，并且F08-69single营养生长期延长，黑暗条件下叶片衰老速度减慢。

全基因组重测序鉴定出At3g10390基因+678bp处G变成A，导致甘氨酸(G)替换为丝氨酸(S)。

另外还发现叶色、叶形和表皮毛发育缺陷的突变，其中一株隐性突变体abt3-1(aberrantly branched trichome 3)，其突变表型为植株小，叶形宽，叶色浓绿，尤其是其出现了高比例的多分支的表皮毛，并且根的生长存在缺陷。

abt3-1根的伸长速率仅为Col-0的三分之一。

通过对根的分生组织中皮层细胞数目和细胞长度的测定，表明abt3-1根的分生区变短。

该研究利用图位克隆技术发现abt3-1中At1g66510的第8个外显子的+33bp处G突变为A，提前引入终止密码子。

回复验证表明At1g66510(ABT3)的突变导致了abt3-1的表型。

ABT3基因编码一个目前功能未知的AAR2(a1- 2 repression 2)家族蛋白。

我们同时对ABT3蛋白的亚细胞定位进行了观察，发现ABT3蛋白定位于细胞质和细胞核中。

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定09生工吴超 200900140129一、实验原理T-DNA插入法是反向遗传学研究的重要手段。

T-DNA是农杆菌的一个大质粒，长度在25kb左右。

野生型农杆菌的T-DNA上带有激素合成基因，感染植物后会导致植物细胞快速增殖形成愈伤组织，失去分化能力。

所以一般实验使用改造后的农杆菌——T-DNA中导入了卡那霉素抗性基因和抗除草剂基因。

因此在农杆菌感染植物后可用除草剂来筛选转化子。

在转化子培养到F2代出现分离后，就需要对其基因型进行鉴定。

T-DNA插入突变体鉴定方法主要有两种：三引物法和双引物法。

在本实验中使用三引物法。

三引物法的原理如图1所示，即采用三引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。

野生型植株目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，分子量约900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，T-DNA本身的长度约为25kb，过长的模板会阻止目的基因特异性扩增产物的形成，所以也只能得到1种以BP与LP或RP为引物进行扩增的产物，分子量约为400-700bp；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到两种产物。

上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。

此法优点是可同时鉴定出纯和突变体并确证T-DNA的插入情况。

图1 T-DNA插入示意图CATB，即十六烷基三甲基溴化铵，是一种离子型表面活性剂。

能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

并且CATB可在高离子强度的溶液里与蛋白质和大多数多聚糖形成复合物进而形成沉淀，但不沉淀核酸。

本实验使用CATB抽提DNA。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术。

它具有特异性高、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至几万倍，使肉眼能直接观察和判断。

实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档

基础上，通过对靶基因进行特定的加工和修饰，如定点突变、插入、缺失、置换等，再研究这些修饰对生物体的表型、性状可能有何种影响，从而了解基因和其编码蛋白质在生物体内的功能。
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养；基因组小，只有5对染色体。拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP）、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系；每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3

拟南芥突变体购买流程-完全图解

最近要购买一批拟南芥突变体，想请教有经验的虫友购买拟南芥突变体的具体流程，例如我需要一个APETALA1的突变体，应到哪个网站进行搜索，怎样进行选择订购，越具体越好，有截图就更好了，谢谢大家了！Step 1. 打开NCBI主页：/打开的页面如下：如下得到如下页面：进一步获得该基因在NCBI里面的基因信息，到此我为什么要做这一步呢，主要是想获得该gene在拟南芥中的系统名，见下图：记住这个名称：AT1G69120这个就是APETALA1（AP1）基因接下来开始查找APETALA1(AT1G69120)的突变体，拟南芥突变体库世界上有很多，公开的没有公开私用的都有，突变的方法也不尽相同，有DS的，T-DNA插入的，Tos17，EMS方法突变的等等。

但是，我们通常用美国SALK研究所的突变体库，这个突变体库比较权威，从这里可以找到几乎现有的所有拟南芥突变体，包括T-DNA插入,RIKEN FST等等各种不同的突变类型，而且有详细的突变位点介绍和购买方法它的搜索界面一目了然,使用也很方便。

下面介绍SALK突变体库的使用方法：Step 2：打开SALK主页：/点击T-DNA Express 进入(红圈处点击)，如下显示：显示如下，所有信息全在如下窗口中从上述窗口中可以获得很多不同group制得的突变体，有SALK T-DNA，CSHL FST(冷泉港实验室的)等等，我个人建议使用SALK 的突变体，订购比较方便，听同学说好像一百美元一个，上图中，蓝色下划线的那两个，以SALK_冠名的那个，两个显示的是不同的插入位置，和T-DNA插入方向(看在图中的位置和箭头方向)点击其中一个进入信息页，比如点击SALK_056708，得到如下页面：我们主要是从ABRC 订购，点击进入页面，填写要求的相关信息，万事大吉。

祝实验顺利！T-DNA Primer Design( Powered by GEBD )Please use the backup page served by AtTA, if the tdnaexpress server is down.The new T-DNA Primer Design Tool is now powered by Genome Express Browser Server (GEBD). The new tool can return the primers faster, and also give the insertion location information, the estimated T-DNA confirmation product size, as well as primer3-like format output. (July 28, 2005)Important Change: Now the RP is always on the side of the flanking sequence, that is, RP is always on the 3' end of the insertion. Therefore, the PCR reaction should always be set up as LB+RP for HM and LP+RP for WT. (Feb. 04, 2005)1. Protocol for SALK T-DNA primer designNote:N - Difference of the actual insertion site and the flanking sequence position, usually 0 - 300 basesMaxN - Maximum difference of the actual insertion site and the sequence, default 300 bpspZone - Regions used to pick up primers, default 100 bpsExt5, Ext3 - Regions between the MaxN to pZone, reserved not for picking up primersLP, RP - Left, Right genomic primerBP - T-DNA border primer LB - the left T-DNA border primerBPos - The distance from BP to the insertion siteLB - Left border primer of the T-DNA insertion:>LBb1 of pBIN-pROK2 for SALK linesGCGTGGACCGCTTGCTGCAACT>LBb1.3(Newly used by Salk Genotyping Project and with better results)ATTTTGCCGATTTCGGAAC>LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK linesTGGTTCACGTAGTGGGCCATCG>LB_6313R for SALK linesTCAAACAGGATTTTCGCCTGCT>LB1 for SAIL lines C/418-451 of pCSA110-pDAP101_T-DNAsGCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC> >LB2 for SAIL lines C/390-423 of pCSA110-pDAP101_T-DNAsGCTTCCTATTATATCTTCCCAAATTACCAATACA>LB3 for SAIL lines C/350-383 of pCSA110-pDAP101_T-DNAsTAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACACTo download SAIL pCSA110 & pDAP101 T-DNAs.By using the three primers (LBb1.3+LP+RP) for SALK lines, users for WT (Wild Type - no insertion) should get a product of about 900-1100 bps ( from LP to RP ), for HM (Homozygous lines - insertions in both chromosomes) will get a band of 410+N bps ( from RP to insertion site 300+N bases, plus 110 bases from LBb1.3 to the left border of the vector), and for HZ (Heterozygous lines - one of the pair chromosomes with insertion) will get both bands. The product size should be 200 base larger if using LBa1 instead of LBb1.3. However, the protocol requires the same or similiar TM values for all the LB, LP and RP primers.You can set up two paired reactions, LP+RP and LB+RP. You should get a product in the LP+RP reaction for WT or HZ lines or get blank for HM lines, while get a band in the LB+RP for HM or HZ lines.。

拟南芥突变体的功能鉴定及应用

拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。

通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。

在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。

拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。

以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。

因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。

因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。

目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。

表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。

对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。

其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。

蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。

分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。

同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。

例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。

利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。

在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。

此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。

拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。

随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。

突变基因的拟南芥实验研究

突变基因的拟南芥实验研究拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，在生物学研究中发挥着重要的作用。

它的基因组序列已经被完整解读，并且其外观简单、生长周期短等特点，使得其成为基因功能研究的最佳实验材料。

突变基因是指由于DNA序列的变异，造成突变的基因。

拟南芥的突变基因贡献了大量关于植物发育与繁殖等方面的科学研究成果。

突变基因的发现突变基因的发现可以通过自然突变和诱导突变两种途径实现。

自然突变是指在自然条件下，由于DNA杂交、突变等自然因素，使得基因产生突变。

而诱导突变，则需要使用特殊的化学试剂或是电磁辐射等手段对DNA进行干预，从而获得突变基因。

诱导突变的方法目前，诱导突变的方法主要有以下几种：1. EMS法EMS是Ethyl methanesulfonate的缩写，是一种碱基化剂，能够导致DNA中的鸟嘌呤碱基突变。

通过对拟南芥幼苗进行EMS浸泡处理，可以获得大量的突变体。

2. Gamma射线法Gamma射线是一种高能辐射，能够直接影响DNA分子结构，从而导致基因突变。

使用Gamma射线进行诱导突变，可以获得不同类型的突变体，包括缺失、插入、点突变等。

3. T-DNA插入法T-DNA是一种细菌表现元（bacterial virulence factor），广泛存在于土壤中的根际细菌Agrobacterium tumefaciens中。

因为T-DNA能够与植物基因组发生同源重组，因此可以通过向植物中转化Agrobacterium，从而将T-DNA插入到植物基因组中，诱导基因突变。

突变基因的分析方法了解突变基因的表达情况，可以通过基因表达谱、荧光素酶检测、Northern blotting、Western blotting等多种方法实现。

其中基因表达谱是最常用的一种方法，能够快速、准确地检测基因的表达情况。

拟南芥突变基因的研究拟南芥作为模式植物，其突变基因的研究对于植物的发育和繁殖等方面具有重要的意义，以下是一些拟南芥突变基因的研究案例。

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定

模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。

实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。

通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。

关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统1.前言拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。

同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。

2.实验2.1实验目的（1）提取植物基因组DNA的方法；（2）PCR操作方法；（3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。

2.2实验原理Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。

将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。

T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。

农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。

“三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。

实验五拟南芥T DNA插入突变纯合体的鉴定

一ml 一三五三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五三’引物[一0 mmol/L]
三0ml反应体系二：
三0ml反应体系四：
二ml 植物基因组DNA样品[WT]
二ml 植物基因组DNA样品[一一一]
三ml 一0×扩增缓冲液
三ml 一0×扩增缓冲液
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml Taqase [五U/ml]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
0.五 ml dNTP[一0 mmol/L]
一ml 一三五三’引物[一0 mmol/L] 一ml 一三五三’引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
一ml LBa 引物[一0 mmol/L]
电泳检测
• 每个大组选两个人点样,电泳结果扫描保存, 下次课看结果,
• LBa一 of pBIN-pROK二 for SALK lines： TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG
植物基因组DNA的快速提取
[一]取植物叶片[拟南芥一片叶子],置于一.五ml离心管中,加入四00 ml提取缓冲液;
[二]用研磨棒研磨植物材料,直至缓冲液变为绿色; [三]在台式离心机上一三000 rpm离心五分钟; [四]离心后将上清三00 ml转移至一个新的一.五 ml离心管中; [五]在上清中加入三00 ml异丙醇,混匀后于室温下一三000 rpm条
用无菌水补足体积,
PCR反应条件
八四℃ 三min 三0循环 [八四℃/一min,五五℃/一min,七二℃/一min]; 七二℃ 延伸一0min,
注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和引物的性质进行合适的调整,
PCR安排

拟南芥隐性抗盐单基因突变体的筛选与鉴定

郭美丽：拟南芥隐性抗盐单基罔突变体的筛选与鉴定１．１２４抗氧化防御系统的活性Ｊ．Ｍ．ＭｃＣｏｒｄ等ｐ“提出的自由基伤害学说，已广泛削于需氧生物细胞伤害机理的研究。

二十世纪８０年代以后，人们对盐分胁迫Ｆ植物体内抗氧化防御系统进行了大量的研究，并己确定它由一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成，如超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）、过氧化氢酶（ｃＡＴ）和抗坏血酸（ＡｓＡ）等，它们协同作用共同抵抗盐分胁迫诱导的氧化伤害，而单一的抗氧化酶不足以防御这种氧化胁迫。

如ＳＯＤ催化两个超氧自由基发生歧化反应形成０２和Ｈ２０２，Ｈ２０２再被ＰＯＤ和ＣＡＴ催化除掉。

在整个氧化防御系统中，ＳＯＤ是所有植物在氧化胁迫中起重要作用的抗氧化酶。

根据结合金属离子的不同，ＳＯＤ可分为Ｃｕ／Ｚｎ—ＳＯＤ，Ｍｎ．ＳＯＤ和Ｆｅ—ＳＯＤ３种类型，Ｃｕ／Ｚｎ－ＳＯＤ主要存在与叶绿素和细胞质中，Ｍｎ．ＳＯＤ主要存在于线粒体中，Ｆｅ—ＳＯＤ主要存在与叶绿体中【３“。

一般来讲，在盐分胁迫下，植物体内的ＳＯＤ等酶活性与植物的抗氧化胁迫能力呈正相关，而且在盐分胁迫下，盐生植物与非盐生植物相比，其ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＰＯＤ活性更高，因而更能有效地清除活性氧，阻抑膜质过氧化。

此外，在盐胁迫下，植物体内的某些过氧化物质，如抗坏衄酸也有清除体内自由基的生理功能。

刘婉等ｐ…认为，离体小麦叶片在盐胁迫加强条件下，体内抗坏血酸含量下降，用活性氧清除剂处理可明显缓解抗坏血酸含量下降，且外源抗坏血酸能明显缓解由盐胁迫造成的对细胞膜的伤害，降低ＭＤＡ含量，提高叶绿体的Ｈｉｌｌ反应活力、叶片光合速率和叶片线粒体呼吸速率。

可见ＳＯＤ和抗氧化物质等自由基清除系统对保护膜结构，提高植物耐盐性有～定作用。

１１．２．５盐胁迫蛋白研究发现，植物在盐胁迫Ｆ，体内合成一些新蛋白称为应激蛋白或胁迫蛋白，而且证明某些应激蛋白与植物的抗盐性有关。

Ｎ．Ｋ．Ｓｉｎｇｈ【４０】等首次报道了，在烟草盐适应悬浮细胞中存在盐胁迫蛋白，此后又发现在烟草、苜蓿、玉米、甜菜等许多作物中存在盐胁迫蛋白，而且尤以分子量为２６ｋＤ蛋白质的含量显著，可占总蛋白的１０％～１２％，且增加量与总蛋白置呈正相关Ｈ”。

拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法

拟南芥属植物分子遗传学和突变体筛选研究方法拟南芥（Arabidopsis thaliana）是目前广泛应用于分子遗传学和突变体筛选的模式植物。

它具有小型体积、短生命周期、易于培养和遗传变异等优点，使其成为研究植物基因功能的理想模型。

下面将介绍拟南芥属植物的分子遗传学和突变体筛选研究方法。

一、拟南芥分子遗传学研究方法2. 基因组学方法：包括全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）、基因芯片（Microarray）和下一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）等技术，用于分析和比较拟南芥基因组的序列、结构和功能。

3.双杂交法：通过构建酵母杂交系统，研究和鉴定拟南芥基因间的物理和功能相互作用关系，进而揭示拟南芥基因调控网络和信号转导途径。

4. RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术：利用沉默诱导的RNA （siRNA）或者镰刀状RNA（hairpin RNA）介导靶向基因的沉默，从而研究和验证拟南芥基因的功能。

二、拟南芥突变体筛选方法1. EMS化学诱变：使用化学诱变剂EMS（Ethyl methanesulfonate），处理拟南芥种子，让其发生突变，形成突变种子库。

进一步筛选和鉴定突变体，识别和研究拟南芥基因的突变功能。

2. 插入序列突变法：通过插入转座子（Transposon）或者T-DNA转座子，将外源序列插入拟南芥基因组，产生随机或特异性的基因突变，进行筛选和分析。

3.含有T-DNA插入的突变体库：使用含有T-DNA插入的突变体库，通过筛选和分离带有T-DNA插入的个体，鉴定和研究拟南芥基因的功能和表达调控。

4.突变体数据库查询：拟南芥基因突变体数据库中收集了大量已经鉴定和命名的突变体信息，可以通过数据库查询，寻找和鉴定具有特定表型的突变体。

8.1 拟南芥T-DNA插入突变与鉴定实验开题报告

拟南芥T-DNA插入突变与鉴定实验开题报告摘要拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。

试验将获得T-DNA插入某基因造成的突变种，插入基因功能进行判断。

筛选出纯种突变型，同时进行PCR法序列鉴定纯种突变型、杂种突变型与野生型。

引言实验背景反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。

经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。

反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。

与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。

T-DNA插入突变技术是反向遗传学的重要手段之一。

T-DNA是根癌农杆菌Ti质粒上的一段DNA序列，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。

T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。

单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。

近年来，借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T-DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。

以T-DNA作为插入元件，不但能破坏插入位点基因的功能，而且能通过插入产生的功能缺失突变体的表型及生化特征的变化，为该基因的研究提供有用的线索。

由于插入的T-DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。

还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。

由此可见，T-DNA插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。

材料选择拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：(1)植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；(2)生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；(3)自花授粉，有助于遗传试验的人工控制；(4)种子多，每株每代可产生数千粒种子；(5)形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；(6)基因组小，只有5对染色体。

拟南芥β-罗勒烯合成酶基因T-DNA插入突变体的鉴定

２ ‘ 置２ｎ，４００ｒｍ离心１ｎ吹干，于０Ｃ放０ｍｉ）１０ｐ０ｍｉ，溶
灭菌的超纯水中后作为ＰＲ扩增的ＤＣＮＡ模板。
１２３ＤＮＡ的ＰＲ扩增．．Ｃ
相似基因组成的家族命名为ＡｔＰＴＳ家族。ｔＰＳ３ＡＴ０
１２２单株植物总ＤＮＡ提取．．
类化合物都具有环状结构。单萜合酶分布于ＴＰ — ，Ｓｂ
ＴＰ — ，Ｐ — 和ＴＳｇ４个亚家族。单萜合酶基因表ＳｄＴＳｆＰ — 达受生物钟调节，表达量随昼夜周期交替变换而出现
ｆ罗勒烯（－ｃｍｅｅ是近年来发现的，植物防｝－￣ｏｉｎ）与御相关的植物通讯（ｌｎ—ｏｐａｔｃｍｍｕｉｔｎ）号分ｎｃｉ信ａｏ子［，自然界中包括两个同分异构体：式一勒１在］顺罗
烯（ｉ一ｃｎｃ￣ｏｉｅ）和反式一－勒烯（ｒｎ — ｓｍｅｆ罗｝￣ａｓｏｉｎ）罗勒烯是一种单萜（ｎｔｒｅｅ）合ｃｍｅｅ。ｍｏｏｅｐｎｓ化
ｓｕｙｔｅｒｌｏ￣ｏｉｎｃａｉｔｄｏｅｆｃｈｍｅｅｍｅｈｎｓｈｍｏｙｏｓｍｕａｔｉ－ｃｎｙｔａｅｅｅｅｐｅｓｎｓｅｃｓｂｏ．ｍ・ｏｚｇｕｔｎｔｏｉｅｓｎｈｓｎｘｒｓｉｉｎｅｍｕｔｅｇｔｗｈ￣ｍｅｇｏｌ
Ｒ０１Ｌ，ｄＨ２补足至１Ｌ。．用ｄＯ５

拟南芥突变体的观察和鉴别

拟南芥突变体的观察和鉴别00911081程万里周一组摘要：拟南芥是目前世界通用的一种高等植物研究的模式生物，属于十字花科，鼠耳芥属，具有其生长快速、后代数量大、遗传和分子实验易操作等等的特点。

这些优点使其成为遗传、发育研究中很好的素材。

本实验选用两种突变型（pid-2和scr-3）与野生型（Ler）进行观察和鉴别，比较其表型上的不同之处并做各种指标的测量以进行确认，最终结果表明pid-2品系发育畸形(表现在花形态异常角果弯曲)，scr-3个体生长缓慢（表现在植株和根的长度较短以及败育现象严重）关键词：拟南芥突变体 pid-2 scr-3 Ler1.引言拟南芥是一种世界通用的，在高等植物研究方面十分重要的模式生物，属于十字花科，鼠耳芥属，个体形态小，具有生长周期快，生命力顽强，后代数量多且遗传操作相对简单等诸多优势。

拟南芥基因组小且测序已全部完成。

这些特点也决定了其在遗传学，发育生物学上的不可替代性。

目前发现的拟南芥共有750多个生态型，不同生态型的拟南芥在形态发育，生理反应方面有着相当大的差异，本次选用的Ler野生型属于常见拟南芥品系之一。

而是用pid-2和scr-3突变体与野生型（Ler）进行对比，可以通过各项指标的对比，确定突变基因对拟南芥发育的影响。

2.材料与方法12.1 材料2.1.1生物材料：拟南芥野生型（Ler）种子突变体（pid-2、scr-3）种子1发育生物学实验讲义2.1.2试剂溶液：70%乙醇10%NaClO（次氯酸钠）无菌水2.1.3 仪器用具：MS固体培养平板玻璃涂棒剪刀镊子胶头吸管三角瓶显微镜1.5ml离心管培养土培养钵2.2方法(1)将种子放于4℃冰箱内2-3天，进行种子的纯化处理(2)取适量种子于1.5ml离心管中，加入1ml 70%乙醇，轻微震荡1min(3)吸去乙醇，加入1ml体积分数为10%的NaClO（次氯酸钠），消毒8-10min(4)吸去NaClO，用无菌水冲洗种子5次后，加入600ul无菌水(5)用移液器将水连同种子吸起，均匀涂布于MS 平板(6)吸去并风干培养基表面多余的水分(7)加盖，封口，置于光照培养箱内(8)7-14天后，当幼苗具4片真叶时转入土壤(9)植株生长6周后，进行野生型和突变体的性状鉴别和数据统计3.结果3.1拟南芥发育各时期图图1示拟南芥发育2周整体观2图2 示发育6周的pid-2突变体外观3图3 示发育6周scr-3品系外观43.2发育6周植株数量统计2由于本人样品未拍摄，此图引自施逸豪同学的样品3引自标准图4引自标准图3.2.1 个人移栽统计情况本组共领取约15颗种子，移栽11颗种子，个人共计移栽2颗种子，在2周时成活两棵，在6周时仅有1棵成活。

毕业论文-拟南芥突变体的鉴定精品

拟南芥突变体的鉴定摘要在真核细胞的细胞核中，基因组DNA缠绕在组蛋白上，形成核小体的结构。

核心组蛋白的末端会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。

这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用。

组蛋白的甲基化发生在赖氨酸和精氨酸位点，这些位点的甲基化参与异染色质形成，X染色体失活和基因转录的激活与沉默等许多重要的生物学功能。

早先认为组蛋白上的甲基化是不可逆的。

然而近年来在哺乳动物和酵母中相继发现了许多组蛋白去甲基化酶。

其中最大的一个基因家族是包含有JMJC结构域的组蛋白去甲基化酶家族。

在植物中还没有报道有组蛋白去甲基化酶。

我们通过基因组注释以及序列比对从拟南芥中鉴定出21个编码包含有JMJC结构域蛋白的基因。

并从SALK突变体库中筛选鉴定了相应的T-DNA插入突变体。

利用分子标记，我们筛选出了37个纯合T-DNA插入株系。

给我们以后分析这些基因在植物生长发育中所起的作用打下了坚实的基础。

关键词组蛋白密码, 甲基化，去甲基化，T-DNA插入突变体1 背景介绍1.1 “组蛋白密码”理论与表观遗传学在真核细胞的细胞核中，基因组DNA与组蛋白和非组蛋白相互结合，构成遗传信息的物质载体——染色质。

染色质由其基本单位核小体重复连接而成，每个核小体包含一个组蛋白八聚体（H2A/H2B-H3/H4-H3/H4-H2A/H2B）和围绕其上的两圈超螺旋DNA（146KB），核小体之间通过不同长度的超螺旋DNA和H1组蛋白前后相接。

组蛋白八聚体的成员作为核小体的基本组成元件，在所有真核生物中高度保守。

尽管核心组蛋白均具有一个三螺旋的结构严整的组蛋白折叠区，其两个末端却没有形成固定结构。

然而，这些末端却会发生一系列翻译后水平上的共价修饰，主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和ADP－核糖基化等。

这些共价修饰在染色质的结构与功能及基因的转录调控方面起着重要的作用（1，2）。

《2024年拟南芥耐铯突变体atbe1-5的筛选及其机理的研究》范文

《拟南芥耐铯突变体atbe1-5的筛选及其机理的研究》篇一一、引言随着工业发展和核技术的广泛应用，重金属铯的污染问题日益严重，对环境和生物体健康构成潜在威胁。

植物作为生态系统的基石，其耐重金属能力的研究对于环境保护和农业可持续发展具有重要意义。

拟南芥作为一种模式植物，其基因组小且易于操作，成为研究植物耐重金属机理的理想材料。

本文以拟南芥耐铯突变体atbe1-5为研究对象，通过筛选和分子生物学手段，探讨其耐铯机理，以期为提高植物耐重金属能力和环境保护提供理论依据。

二、材料与方法（一）材料本文选用拟南芥耐铯突变体atbe1-5为实验材料。

（二）方法1. 拟南芥突变体的筛选：采用化学诱变法获得耐铯突变体atbe1-5，通过铯处理实验筛选出具有较高耐铯能力的突变体。

2. 基因克隆与序列分析：利用PCR技术克隆突变体atbe1-5的耐铯相关基因，进行序列分析和功能预测。

3. 表达分析：通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测耐铯相关基因在突变体及野生型拟南芥中的表达情况。

4. 亚细胞定位：利用基因克隆和亚细胞定位技术，研究耐铯相关蛋白在细胞中的定位情况。

5. 转基因植物构建与功能验证：构建过表达和敲除耐铯相关基因的转基因拟南芥，验证其功能。

三、结果与分析（一）耐铯突变体atbe1-5的筛选与鉴定通过化学诱变和铯处理实验，成功筛选出耐铯能力较强的突变体atbe1-5。

与野生型拟南芥相比，该突变体在铯处理下表现出较高的生长活力和生物量。

（二）基因克隆与序列分析成功克隆了突变体atbe1-5的耐铯相关基因，并进行序列分析和功能预测。

结果表明，该基因编码一个未知功能的蛋白质，可能与铯的吸收、转运和耐受有关。

（三）表达分析qRT-PCR结果显示，耐铯相关基因在突变体atbe1-5中的表达量显著高于野生型拟南芥。

这表明该基因在提高拟南芥耐铯能力方面发挥重要作用。

（四）亚细胞定位通过亚细胞定位技术发现，耐铯相关蛋白主要定位于细胞膜和细胞质中，这表明该蛋白可能参与铯的吸收和转运过程。

模式植物拟南芥tdna插入突变体的鉴定

模式植物拟南芥tdna插入突变体的鉴定姓名系年级学号日期科目遗传学实验题目模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。

在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。

本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。

实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。

现广泛应用于核酸的研究中。

引言Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。

所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。

将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。

T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。

如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。

所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。

农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。

这使农杆菌Ti 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。

反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突变体的鉴定方法。

拟南芥突变体相关分析

拟南芥突变体的相关研究遗传学摘要：本文列举了利用正向遗传法对拟南芥突变体的筛选、遗传群体的初步遗传群体及初步遗传图谱的构建和基因的图位克隆、遗传分析及相关基因的功能分析的流程，为拟南芥的研究提供更明确更清晰的思路。

关键词：拟南芥突变体；筛选；图位克隆；功能分析1 拟南芥突变体的筛选拟南芥是十字花科拟南芥属植物，近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。

拟南芥的另一优点是很容易被诱变，目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体，这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用。

拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。

这里拟南芥耐低钾突变体的筛选为例，介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。

1.1植物材料诱变以拟南芥为材料，诱变方法如下：称取250mg(约5000粒）野生型种子置于50ml烧杯内并加入25ml 重蒸水，搅拌30 分钟；在4℃，下放置12小时后，把种子转移到盛30ml100mmol/L 磷酸缓冲液（PH6.5）的100ml三角瓶中，加入0.2%（V / V）的甲基磺酸乙酯（EMS），封口后放在水浴（25℃）振荡器上振荡12h。

然后用50ml 蒸馏水漂洗种子4 次，每次15min。

将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。

1.2诱变植株培养将经EMS诱变处理后的拟南芥种子（M1）播种于1/4Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中，然后覆膜保湿。

18-22℃、光照强度120umol/m2s-1、光周期16h/8h条件下培养，待种子成熟后分行采收种子。

1.3 突变体的筛选拟南芥种子用0.5 %（v/ v）次氯酸钠加0.1%（v/ v）Tri-tonX-100表面消毒10 分钟，再用无菌水冲洗3遍。

接种前种子与0.4%（w/ v）低熔点琼脂糖混和，然后用吸管将种子吸出，成行地涂于MS 培养基上；将培养皿置于4℃冰箱春化48小时，之后转入光照培养，培养皿垂直放置。

拟南芥抗菌核病突变体的筛选

用Ｔ—ＤＡ插入突变创造抗／表型，后克隆研Ｎ感然
究相关基因。Ｌｕ等发展了一种有效的热不对ｉ称ＰＲ（ｈｒａａｙｍｔｃｉｔｌｃｄＰＲ，ＡＬ— ＣｔｍｌｓｍｅｒｎｒｅＣＴＩｅｉｅａ
试验用拟南芥突变体由中国科学院遗传与发育生物学研究所左建儒实验室构建・，独特的化］是
诱导激活标签系统创造的５６１６０株拟南芥突变体。
筛选方面，尽管经过几十年努力，筛选了数千份品种资源，到了数份高耐菌核病的材料，在所有菌核得但病寄主作物中，目前未发现免疫类型育种仍面临很多困难。，也没有得到满足研究和育种需求的抗源，遗传研究和抗病使
学诱导型的激活标签突变，有材料为Ｃｌｍｉ所ｏｕｂａ生态型。本研究所用群体为转基因Ｔ２代扩繁的种子（２代苗经卡那霉素筛选后，抗卡那霉素单株上Ｔ从
收获的种子）分单株收获，后每２，然０个独立的转
染所造成的一种世界性病害，以感染７可５个科，５４０
多种植物种或亚种 … ，病是油菜最严重的病该害］。对作物抗菌核病鉴定筛选方法、源筛选和抗转基因抗病品种的培育已有较多的研究报道目的的方法。在抗病鉴定方法方面已形成了适用于不同抗性鉴定，中菌核病毒素草酸法可对油菜其

拟南芥耐硒突变体的鉴定及基因定位

拟南芥耐硒突变体的鉴定及基因定位作者：陈大清钟育海李应生来源：《湖北农业科学》2018年第02期摘要：在硒盐胁迫下通过根弯曲特性筛选获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）耐硒突变体，并以突变体为母本与野生型（Ler）杂交获得基因型完全杂合的F1代；自交产生的F2代硒敏感，硒耐受的分离比为3∶1，表明该突变体是隐性单基因遗传。

F2代选出132株具有耐硒特性的植株作为图位克隆的群体，从应用SSLP和In/Del分子标记进行基因定位，通过分析目的基因与各分子标记之间的连锁关系，发现耐硒突变体基因位于第I号染色体F12P19和NGA111的分子标记之间。

关键词：拟南芥（Arabidopsis thaliana）；硒盐胁迫；突变体；基因定位中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）02-0115-04DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2018.02.029Abstract： A selenate-torlerance arabidopsis mutant was obtained by using the root-bending trait under selenate stress. It was conformed that the selenate resistant characteristics could be steady inheritance. Then this mutant was crossed with the wild-type Ler. and F1 generation were created with heterozygous type completely. The F2 crossed by theirself were expressed the separation ratio of 3∶1 in response of sensitive selenium to resistent selenium，It were suggested that this mutant was a monogenic recessive mutation. Map-based cloning population were composed of the 132 selenate-tolerance seedlings in F2 generation. Using SSLP and In/Del based on PCR to preliminary chromosomal location. Through linkage analysis，it's indicated that this mutant gene was located on the chromosome I，which was mapped between molecular marker F12P19 and NGA111.Key words： Arabidopsis thaliana； selenate stress； mutant； gene lacation微量元素硒（Se）不仅是人、动物和微生物的必需营养元素，也是植物生长发育的有益元素[1，2]。