第二章-3 目的基因获得

1989
Science杂志将PCR列为十余项重大科学发明之首
，
1991.12比喻Ce1t9u89s年以为$3P亿C将R专爆利炸年卖。给Hoffmann-La Roche公 司
Eppendorf ABI
Bio-rad
PCR法扩增目的基因的前提：
已知目的基因全序列或其两侧序列， 化学合成与模板互补的上、下游引物。
问题：可能造成目的基因碱基序列的改变。
原因： Taq酶无3’→5’外切酶活性，无 阅读校正功能，在扩增过程中会引起错配， 30次循环Taq酶错配率约0.25％。
措施：选择高保真Taq酶，如Pfu。
由Taq酶扩增的PCR产物，3’末端总是带 有一个非模板依赖型的突出碱基，而这个碱基几 乎总是A因，Taq酶对dATP具有优先聚合活性。
1998.04 Mullis KB. Dancing naked in the mind fields.
The Nobel Prize in Chemistry 1993
1972 在加州大学伯克利分校获得博士学位 1979 进入私人生物技术公司Cetus
1983.03 开汽车时的联想： 蜿蜒崎岖的山路--DNA双螺旋 行驶的汽车--一小段DNA引物
变性：双链DNA解链为单 链DNA；
变性
退火：引 物 与 模 板 单 链 退火 DNA的特定互补部 位配对、结合； 延伸
延伸：以目的基因为模板， 合成互补的新DNA 链。
由于每一循环所产生的DNA片段均能成为 下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增 加，即Y=2n (n为循环次数)。
3 0 th cycle ？ 230(109)copies
第二章 基因工程的基本条件
一、用于核酸操作的工具酶 二、基因克隆载体 三、目的基因的获得 四、基因工程受体菌或细胞
三、目的基因的获得
限制酶酶切直接分离法 PCR扩增法 从mRNA合成cDNA 化学合成法 通过构建基因文库分离法
（一）限制酶酶切直接分离法
对已克隆在载体中的目的基因，可根 据目的基因两侧的限制酶识别序列，选择适 当的限制酶酶切，获得目的基因。 注意：
哺乳动物的网织红细胞中珠蛋白 mRNA的比例占总mRNA的90%以上。
高丰度mRNA： 目的mRNA在细胞中的含量占细胞
质总mRNA量的50-90%。
低丰度mRNA： 目的mRNA在细胞中的含量占细胞
质总mRNA量的0.5%以下。
步骤：
钓取目的基因的mRNA
逆转录酶催化合成cDNA第一链
逆转录酶去除mRNA-cDNA 杂交链中的mRNA链
1986.05 冷泉港“人类分子生物学”专题研讨会
1987.01 Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology. 1987,155:335-50.
1983.08 正式做有关PCR原理的报告 1983.09 Mullis开始动手做实验 1984.11 首次取得可信结果 1985.01 Randall Saiki加入，结果毋庸置疑
1985.03 Cetus公司申请专利
1985.12 Saiki RK, Scharf SJ, Faloona FA, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985,230(4732):1350-4.
HIS4
5’ AOX1
Bgl II
Ampr
pPIC9K
9.3 Kb
ColE1 Bgl IIHale Waihona Puke Baidu
3’ AOX1
Kanr
HIS4
ColE1
Bgl II 3’AOX1 Kanr
（二）PCR法扩增目的基因
PCR(polymerase chain reaction)： 利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通
过变性-退火-延伸的循环操作，在体外迅 速将DNA模板扩增数百万倍的操作技术。
1986.06 Saiki等将耐热DNA聚合酶--Taq酶引入PCR技术 。 1986.09 Mullis离开Cetus公司
1988.01Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988,239(4839):487-91.
Klenow酶合成cDNA第二链
目的基因内部不能有该限制酶的切点， 否则目的基因会被切成碎片！
Ampr
f1ori lacZ
pGEM-T/hVEGF165 hVEGF165 3.5 Kb
SnaB I EcoR I Avr II Not I
EcoR I Not I
5’AOX1 hVEGF165
Bgl II Ampr
pPIC9K/hVEGF165 9.8 Kb
PCR技术的发明--DNA操作技术的革命 发明人：美国生化学家Kary B. Mullis
1990.04 Mullis KB. The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 1990,262(4):56-61,64-5.
可用T载体克隆。
5
A
A’
5
PCR扩增产物 ’
T7 lacZ MCS ori Ampr
5’
T
T
5’
T载体
（三）从mRNA合成cDNA
以目的基因的mRNA为模板，在逆 转录酶作用下合成cDNA第一链，然后在 Klenow酶作用下合成双链cDNA。
此法适用于mRNA丰度极高的目的 基因克隆，如血红蛋白珠蛋白基因。