抗体的纯化与检测详细版..
抗体的检测和纯化课件
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
• Protein A
• A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
•
Protein A--Sepharose CL24B 亲和层析法
的原理是,A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地
结合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合
力,结合的强弱程度依次是: IgG2a > IgG2b >
IgG3 > IgG1 。A 蛋白的这种结合也是具有p
H 依赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯
化与其结合较弱的IgG1。
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
方法
1 腹水的处理 取腹水,在4 ℃,12 000g 条件下 离心15min ,以除去较大的凝块。
2 装柱 将1. 5g Protein A-Sep harose CL-4B 干 粉用6～7ml 三蒸水溶解,再用0. 02M ,p H 7. 4 的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液) 浸泡15min ,然 后装入层析柱中。
一 饱和硫酸铵沉淀法
•
饱和硫酸氨沉淀是从溶液中分离蛋
白质的常用方法。这是一种比较原始，非
特异性分离技术。
•
饱和硫酸氨沉淀法难以得到高纯度
抗体纯化及纯 度的检测课件2012.11.27
三、层析分离
离 子 交 换 层 析 法
四、硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法纯化IgG 在pH7.5的溶液中IgG带正电，其一次将IgG提纯到很高的纯度
四、IgM的纯化方法：18%饱和度硫铵沉淀 +DEAE-纤维素柱层析法。
透析袋的处理
⑤电泳— SDS-PAGE
一、硫铵盐析法 简便、蛋白质变性较少，33%饱和度的硫铵可以沉淀所有 各类免疫球蛋白；缺点是分离的纯度较差，对IgA类抗体 来说，浓盐可使其形成二聚体，不宜采用。
一、原理 当高浓度盐存在时，蛋白质表面的电荷基团和极性基团与溶液中的离
子配对，瓦解了以电荷为基础的蛋白质---蛋白质相互作用。加之高盐能促进蛋白
试剂: 1. 硫酸铵 2. 10mM pH7.4的磷酸盐缓冲液
硫酸铵沉淀流程
样品 ↓ ↙硫酸铵粉末（20%） 搅拌 ↓ 静止放置1小时 ↓ 离心 ↙↘ 上清 沉淀 ↓↙硫酸铵粉末（80%） 搅拌 ↓ 静止放置2小时 ↓ 离心 ↙↘ 上清 沉淀（30%-80%硫酸铵饱和液） ↓ 缓冲液溶解 透析
拌器上边温和搅拌，边加入3.84g硫酸铵粉末至80%饱和；
6. 4℃放置2h后，用8000g离心20min； 7. 弃去上清液，取0.5 mL 生理盐水溶解沉淀；
8. 装入透析袋，用0.0175mol/L PBS（pH 7.4）透析1d，期
间换透析液6次。
二、Cohn冷酒精沉淀法：
三、层析分离
凝 胶 过 滤 ( 分 子 筛 层 析 )
操作步骤
1. 将硫酸铵晶体在乳钵中研磨成粉末状；
2. 将盛有5ml蛋白质溶液（血液或消化液）的烧杯放在另一
装有冰水的溶器内，并置于磁力搅拌器上搅拌； 3. 加5mL生理盐水，边搅拌，边徐徐加入1.06g硫酸铵粉末
纯化抗体蛋白的详细实验流程
纯化抗体蛋白的详细实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在进行纯化抗体蛋白之前，需要做好充分的准备工作。
纯化及鉴定实验报告
纯化及鉴定实验报告
1. 实验目的
本实验旨在提取、纯化和鉴定人类血浆中的抗体IgG。
2. 实验步骤
1. 血浆样本制备：
- 收集人类血浆样本，并离心去除细胞成分。
2. 抗体IgG的提取：
- 使用亲和层析技术，将血浆样本加入与IgG特异性结合的柱中，洗脱非特异性蛋白质。
3. 抗体IgG的纯化：
- 将柱中特异性结合的IgG洗脱并收集。
4. 抗体IgG的鉴定：
- 使用免疫学技术（如ELISA或免疫印迹），检测提取的IgG 的纯度和特异性。
3. 实验结果
经过上述步骤，实验成功提取和纯化了人类血浆中的抗体IgG。
通过免疫学技术的鉴定，确定提取得到的IgG具有较高的纯度和特
异性。
具体的实验结果表明人类血浆中存在丰富的抗体IgG。
4. 结论
本实验成功地提取、纯化和鉴定了人类血浆中的抗体IgG。
这
对于进一步研究和应用抗体在医学和生物学领域具有重要意义。
5. 讨论和展望
本实验采用了亲和层析技术和免疫学技术，成功实现了对人类
血浆中抗体IgG的提取、纯化和鉴定。
然而，未来的研究可以探索
更有效的提取和纯化方法，以及进一步验证抗体的功能和应用，扩
展该实验研究的深度和广度。
参考文献
[1] 张三, 李四. 血浆抗体IgG的提取与纯化[J]. 实验生物学杂志, 20XX, XX(X): 123-456.。
抗体纯化手册
抗体纯化手册一、引言概述嘿，小伙伴们！咱们今天来讲讲抗体纯化这事儿呢。
抗体纯化啊，就像是从一堆杂物里把宝贝挑出来一样，超级有趣又特别重要。
在生物研究领域，抗体纯化可是相当关键的一步哦。
二、使用范围说明这个抗体纯化呢，在很多地方都能用得到。
比如在医学研究中，当我们想要研究某种疾病相关的抗体时，就需要把抗体纯化出来，这样才能准确地进行检测、分析啥的。
还有在生物制药方面，纯化后的抗体可以用来制作药物，治疗各种疾病。
三、操作步骤指南1. 样品准备首先得收集含有抗体的样品啦，这个样品可能来自细胞培养上清液，也可能是血清之类的。
收集的时候要小心哦，可不能把样品搞污染了。
就像你从果园里摘水果，要挑那些完好无损的一样。
然后对样品进行预处理，可能需要过滤一下，把那些大的杂质颗粒去掉。
这就像是筛沙子，把大石头筛出去，留下细沙一样。
2. 选择纯化方法有亲和纯化法，这是一种比较常用的方法。
就像磁铁吸引铁屑一样，亲和纯化利用抗体和特定配体之间的特异性结合来纯化抗体。
不过呢，这个方法需要先准备好合适的亲和介质哦。
离子交换纯化法也不错。
根据抗体的电荷性质，让它在离子交换柱上进行吸附和洗脱。
这就有点像按照颜色把小珠子分类，不同电荷的抗体就像不同颜色的珠子。
凝胶过滤纯化法呢，是根据抗体的大小来进行分离的。
大的分子先流出来，小的分子后流出来，就像大的球先从管道里滚出来，小的球后滚出来一样。
3. 进行纯化操作按照所选的纯化方法，把样品加到相应的柱子或者设备里。
如果是亲和纯化，要注意控制流速，不能太快，不然抗体和配体还没结合好就被冲走了。
这就像你浇水的时候，水流不能太急，不然种子会被冲走一样。
在洗脱的时候呢，要选择合适的洗脱液。
这个洗脱液的浓度啊、pH值啊都很重要。
就像调鸡尾酒，各种成分的比例要合适才能调出好喝的酒。
收集纯化后的抗体，要收集在干净、无菌的容器里。
这就像把采到的蜂蜜放在干净的罐子里一样。
四、功能特点介绍纯化后的抗体有很多厉害的地方哦。
抗体的提取与纯化
(关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B 亲合层析纯化IgG；离子交换层析)精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法分离过程如下。
血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。
在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。
产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。
沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA 和IgM，IgG留在上清液内。
调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。
所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。
不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。
纯化及鉴定实验报告
纯化及鉴定实验报告
引言
本实验旨在分离、纯化和鉴定血浆抗体。
血浆抗体是免疫系统
抵抗外来病原体的重要组成部分，对于抗体的纯化和鉴定可以为疾
病诊断和治疗提供重要参考。
实验方法
1. 血浆样品采集：收集健康人士的血浆样品，并进行初步筛选，排除病原体感染者。
2. 抗体分离：采用某种分离方法（如凝胶过滤、电泳或亲和层析）将血浆中的抗体分离出来。
3. 抗体纯化：对分离得到的抗体样品进行纯化处理，去除杂质
和其他成分，使抗体得到更高纯度。
4. 抗体鉴定：通过某种特定的实验方法（如酶联免疫吸附试验、荧光染色或免疫荧光）对纯化得到的抗体进行鉴定，确认其特异性
和活性。
实验结果
1. 成功分离和纯化了血浆中的抗体样品。
2. 经过鉴定的抗体样品表现出特异性和活性，证实其对特定病原体或抗原的识别和结合能力。
结论
通过本实验的分离、纯化和鉴定过程，成功获得了高纯度、特异性和活性的血浆抗体样品。
这为后续的疾病诊断和治疗研究提供了有价值的参考。
参考文献
（如果有的话，请列出参考文献）。
抗体的提纯实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握抗体提纯的基本原理和方法。
2. 学习并掌握利用亲和层析法、盐析法等方法对抗体进行提纯。
3. 评估提纯效果，确保抗体纯度。
二、实验原理抗体是一种具有特异性的蛋白质，主要存在于血清、组织液等体液中。
抗体提纯的目的是去除抗体中的杂质，提高其纯度和活性。
常用的抗体提纯方法有亲和层析法、盐析法、离子交换层析法等。
亲和层析法：利用抗体与抗原之间的高亲和力，将抗体吸附在特异性抗原上，通过洗脱剂洗脱抗原，实现抗体与抗原的分离。
盐析法：利用盐离子对蛋白质溶解度的影响，通过调节溶液中的盐浓度，使抗体沉淀出来。
三、实验材料1. 实验试剂：抗体溶液、抗原溶液、亲和层析柱、盐析剂、离子交换层析柱、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、分光光度计、移液器、培养箱、冰箱等。
四、实验步骤1. 亲和层析法（1）将抗体溶液过柱，用缓冲液平衡亲和层析柱。
（2）将抗原溶液加入亲和层析柱，使抗体与抗原结合。
（3）用洗脱剂洗脱未结合的抗原，收集抗体洗脱液。
（4）将抗体洗脱液离心，收集上清液。
2. 盐析法（1）将抗体溶液加入适量的盐析剂，调节盐浓度至抗体沉淀的适宜范围。
（2）静置一段时间，使抗体沉淀。
（3）离心收集抗体沉淀，用缓冲液溶解沉淀。
（4）检测抗体溶液的浓度和活性。
3. 离子交换层析法（1）将抗体溶液过柱，用缓冲液平衡离子交换层析柱。
（2）根据抗体带电荷性质，选择合适的离子交换层析柱。
（3）通过改变缓冲液的离子强度，使抗体吸附在层析柱上。
（4）用梯度洗脱剂洗脱抗体，收集抗体洗脱液。
（5）离心收集抗体洗脱液。
五、实验结果与分析1. 亲和层析法通过亲和层析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
通过SDS-PAGE电泳检测，抗体分子量与预期相符。
2. 盐析法通过盐析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
通过SDS-PAGE电泳检测，抗体分子量与预期相符。
3. 离子交换层析法通过离子交换层析法提纯抗体，得到纯度较高的抗体溶液。
抗体的检测和纯化(4)
• Protein A/G亲和层析 • 亲和层析是一种快速有效的生物活 性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对 目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得 较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应 用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂 贵,使用成本较高,限制了它的运用
• Protein A • A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
精度纯化
• 目的：保证最终抗体产品纯度，能有效对 潜在的污染物，如宿主细胞蛋白 (HCP)、免 疫球蛋白、宿主DNA； • 对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、 其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析 出成分 (脱落的蛋白A配基) 进行去除；并能 有效的去除/灭活病毒。
建议的工艺
• 首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行 澄清 (Cell removal)； • 然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件 洗脱后直接pH 4.0病毒灭活； • 澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere； • 这一步离子交换之前或之后会有一步20nm 纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进 行缓冲液置换。 • 有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通 过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求
目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集 体和变体等。 常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、 疏水层析等。
抗体纯化以及蛋白浓度测定程序
抗体纯化以及蛋白浓度测定程序操作程序实验试剂及仪器试剂：Sulfolink couping gel（THERMO）、层析柱、氯化钠、1*PBS 、1M Tris、100mM 甘氨酸（pH2.2）、EDTA(pH 8.5)、甘油仪器：恒流泵、旋转培养器流程：（一）亲和层析柱的制备原理：活化的琼脂糖凝胶通过偶联抗原蛋白的巯基，从而使抗原结合在固相载体上试剂：偶联Buffer (50mM tris、5Mm EDTA-NA)PH 8.5Wash buffer(1*PBS 320mM 氯化钠)1)称取8-10mg多肽，用2ml 偶联Buffer 溶解，蛋白则根据蛋白浓度取合适体积，总含量在10mg左右。
2)取2ml Sulfolink couping gel于层析柱中，将抗原加入层析柱于旋转培养器上旋转2-3小时（二）抗血清纯化1)将层析柱静置在层析架上30分钟，连接恒流泵。
2)平衡40ml 1*PBS流速2.0、30ml 1*Gly、30ml 1*PBS将柱子内环境平衡到中性3)上样样品中加入1/20 4M 氯化钠，流速1.3-1.6，过柱两遍4)WASH 加入40ml Wash buffer5)收样加入1*Gly流速0.5-0.7,收集8管，每管2ml 共16ml。
6)收集完之后，加入过量的酸将抗体洗脱干净，再用1*PBS平衡到中性7)将收集的抗体放入透析袋中，混匀之后取30微升左右用于抗体浓度测定，其余放入1*PBS50%甘油中透析浓缩过夜8)将透析浓缩好的抗体放入灭菌的5毫升冻存管中，贴上标签-20摄氏度保存注意事项：1.纯化过程中琼脂糖保持在液体环境中，切忌抽干2.上样及洗脱流速不可过快3.对于纯化磷酸化修饰或者其他修饰的抗体时，则需要先过其对照柱两遍，其中收集一遍，在纯化磷酸化抗体项目：LOWRY法测蛋白原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物），在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量试剂：Folin—酚试剂、4%碳酸钠溶液、0.2mol/L氢氧化钠溶液、0.04mol/L硫酸铜溶液、2%酒石酸钾钠溶液、1mg/ml BSA、1*PBS碱性铜溶液：按比例取试剂配置而成仪器：恒温箱、分光光度计流程1.根据蛋白质浓度，分别精确量取不同体积的标准蛋白质溶液，各加PBS补至0.2ml，使标准蛋白的溶度分别为0，12.5，25，50，100，200∪g/ml2.精确量取样品加PBS补至0.2ml3.将标准曲线和样品各加1ml碱性铜和0.1ml酚试剂混匀，在750nm处测OD4.以标准蛋白的浓度为Y轴，光吸收值为X轴，得一标准曲线。
抗体的纯化与检测详细版
注意事项：选择 合适的荧光标记 抗体避免非特异 性结合
抗体纯化与检测的应 用
疾病诊断
抗体检测：通过检测抗体水平判断疾病状态 抗体纯化：提高抗体检测的准确性和灵敏度 抗体检测的应用：用于诊断多种疾病如传染病、肿瘤等 抗体纯化的应用：提高抗体检测的特异性和灵敏度降低假阳性和假阴性率
药物研发
抗体纯化与检测在药物研发中的作用：提高药物的疗效和安全性 抗体纯化与检测在药物研发中的具体应用：抗体筛选、抗体工程、抗体药物研发等 抗体纯化与检测在药物研发中的技术难点：抗体的纯化、抗体的检测、抗体的稳定性等 抗体纯化与检测在药物研发中的发展趋势：抗体药物的个性化治疗、抗体药物的靶向治疗等
步骤：样品制备、 电泳分离、转膜、 封闭、抗体孵育、 显色、结果分析
优点：灵敏度高、 特异性强、操作 简便、结果直观
应用：广泛应用 于蛋白质表达分 析、疾病诊断、 药物研发等领域
流式细胞术
原理：利用荧光 标记抗体通过流 式细胞仪检测细 胞表面抗原
优点：快速、灵 敏、准确
应用：免疫学、 肿瘤学、血液学 等领域
根据实验目的选 择检测方法：如 定量检测、定性 检测等
实验数据的分析和解读
数据的完整性：确保实验数 据的完整性避免遗漏和缺失
数据的时效性：确保实验数 据的时效性避免过时和失效
实验数据的准确性：确保实 验数据的准确性避免误差和 偏差
数据的解读：根据实验数据 进行合理的分析和解读得出
结论和结论
感谢您的耐心观看
生物科学研究
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 重要性
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 应用实例
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 发展趋势
抗体纯化与检测在 生物科学研究中的 挑战与机遇
天津医科大学抗体纯化与鉴定技术-09
操作：
20
注意问题：
21
方法三:
DEAE离子交换层析提取IgG
实验原理：
DEAE-Sephadex A-50 阴离子交换树脂能吸附阳离子； 血清中的γ-球蛋白属于中性蛋白，其余 均属酸性蛋白。在pH7.2～7.4的环境中, 酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附， γ-球蛋白不被吸附而得以纯化。
冷冻保存 4℃保存
30
THE END
31
8
操作：
技术路线 33%饱和硫酸铵沉淀留沉淀 50%饱和硫酸铵沉淀留沉淀 分离血清等倍稀释
9
操作：
注意事项 硫酸铵的质量 饱和硫酸铵溶液配制 蛋白质浓度 盐析过程 脱盐
10
操作：
透析除盐
11
方法二:
葡萄球菌蛋白A亲和层析提取IgG
实验原理：
蛋白A（ Protein A ）或蛋白G （ Protein G ）是细菌胞壁蛋白，它们 能结合抗体Fc段。天然 Protein G具有3 个IgG结合域， 天然的Protein A具有5 个IgG结合域。这一结合非常牢固，但 其亲和力对pH的变化敏感，抗体/蛋白A 或蛋白G的亲和力随pH的降低而急剧降 低。
抗体纯化与鉴定技术
临床免疫学教研室
李会强 教授
抗体纯化的目的
去除：
杂抗体（交叉反应抗体） 杂蛋白（提纯IgG及其片段）
2
方法一:
盐析法粗提丙种球蛋白
实验原理：
蛋白质溶解度在一定范围内随盐的浓度 变化而变化。在低盐浓度下溶解度随盐 的浓度升高而增加，当盐浓度达到一定 水平时，其溶解度又以不同程度下降并 先后析出。
6
主要试剂：
多克隆抗体的制备,纯化及检测
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳【实验目的】⒈ 加深对抗体基本知识的了解。
⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
一、多克隆抗体的制备【实验原理】当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
【实验材料】⒈ 实验动物初次抗原注射后的周次0 1 2 3 4 5 6 7初次免疫 二次免疫血清中抗体的水平成年兔。
⒉实验器材特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。
⒊实验试剂⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。
⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂：【实验方法】⒈抗原的制备抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。
由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。
纯化及鉴定实验报告
纯化及鉴定实验报告简介本实验旨在提取、纯化和鉴定血浆中的免疫球蛋白G（IgG）。
IgG是一种重要的抗体，在免疫反应中起到关键作用。
本实验使用了以下步骤进行提取、纯化和鉴定。
材料和方法1. 血浆样品：收集来源于健康志愿者的血浆样品。
2. 蛋白A亲和树脂：用于IgG的亲和层析纯化。
3. 层析缓冲液：用于洗脱和纯化IgG的缓冲液。
4. SDS-PAGE凝胶：用于鉴定IgG的纯度和分子量。
5. Coomassie Blue染色液：用于染色分析。
提取和纯化步骤1. 加入血浆样品到蛋白A亲和树脂柱，并进行洗涤以去除非特异性结合物。
2. 用层析缓冲液洗脱IgG，并收集纯化的IgG溶液。
3. 确定纯化的IgG样品的浓度。
鉴定步骤1. 将纯化的IgG样品加载到SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
2. 可选择使用Western blot方法进一步确认IgG的特异性。
3. 使用Coomassie Blue染色液染色，观察IgG在凝胶中的迁移情况并分析纯度。
4. 使用分子量标准品确定纯化的IgG的分子量。
结果根据本实验的步骤和方法，成功提取、纯化并鉴定了血浆中的免疫球蛋白G。
讨论本实验采用蛋白A亲和层析的方法提取和纯化血浆中的IgG。
结果表明提取纯化后的IgG具有一定的纯度，符合实验要求。
通过SDS-PAGE凝胶和Coomassie Blue染色的分析，可进一步确认纯化的IgG的分子量和纯度。
结论本实验成功实现了血浆免疫球蛋白G的提取、纯化和鉴定。
这个实验方法可以用于从血浆中获得高纯度的IgG样品，为后续研究和应用提供基础。
参考文献（仅供参考）[1] Smith A, et al. Purification and characterization of immunoglobulin G (IgG). Journal of Immunological Methods.20XX;XXX(X):XX-XX.。
详细介绍抗体的分离纯化
12/12/2016
离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团
，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂
。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
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阳离子交换反应：R-A- H+ + Y+ —R-A- Y+ + H+
阴离子交换反应：R-B+ OH- + X- —R-B+ X- + OH-
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影响离心法的因素
离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度 （一）离心速度 低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如5000r/min等。 高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，如60000×g等。 相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。即：
一、盐析法
在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过 程称为“盐析”。
增加盐浓度能够增强蛋白间的疏水相互作用,疏水性的不同导致了一个选择性沉淀。
优点：①成本低，不需要昂贵的设备；
②操作简便，安全；
③对许多生物活性物质具有稳定作用；
④对pH、温度要求不严格。
缺点：分离效果有限
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12/9/2016
常用的沉淀剂
沉淀剂 硫酸铵 右旋硫糖苷
使用的典型条件
样品类型
备注
下文有叔
大于1mg/ml蛋白, 特别使免疫球蛋 白
用于稳定的蛋白,不会变 性,上清可以直接 上到 HIC（疏水层析柱）,减少了脂蛋白 含量
加入0.04 ml of 10% 右旋硫糖苷和1 ml of 1 M 可用于高脂蛋白的样品,例如腹水
抗体分离纯化实验报告
一、实验目的1. 学习抗体分离纯化的原理和方法。
2. 掌握蛋白A亲和层析、离子交换层析等常用分离纯化技术。
3. 提高实验操作技能，提高抗体纯度。
二、实验原理抗体分离纯化是指从复杂的生物样品中提取、分离和纯化目标抗体。
常用的分离纯化方法有蛋白A亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
本实验采用蛋白A亲和层析和离子交换层析相结合的方法，以提高抗体的纯度。
三、实验材料1. 抗体样品：经培养的杂交瘤细胞上清液。
2. 蛋白A亲和层析柱：Protein A Chromatography Column。
3. 离子交换层析柱：Sephadex G-25。
4. 离心机、冰箱、超声波破碎仪、移液器、滤纸等。
四、实验方法1. 蛋白A亲和层析（1）将抗体样品经0.02M PBS（pH 7.4）平衡蛋白A亲和层析柱。
（2）将抗体样品上柱，流速控制在1ml/min。
（3）用0.02M PBS（pH 7.4）洗涤柱，去除非特异性结合的蛋白。
（4）用含有0.1M甘氨酸-HCl（pH 3.0）的溶液洗脱结合的抗体，流速控制在1ml/min。
（5）收集洗脱峰，得到纯化的抗体。
2. 离子交换层析（1）将纯化的抗体样品经0.02M PBS（pH 7.4）平衡Sephadex G-25层析柱。
（2）将抗体样品上柱，流速控制在1ml/min。
（3）用0.02M PBS（pH 7.4）洗涤柱，去除小分子物质。
（4）用0.1M NaCl溶液洗脱结合的抗体，流速控制在1ml/min。
（5）收集洗脱峰，得到高纯度的抗体。
五、实验结果1. 蛋白A亲和层析：洗脱峰中抗体浓度明显升高，纯度提高。
2. 离子交换层析：洗脱峰中抗体浓度进一步升高，纯度达到95%以上。
六、实验讨论1. 本实验采用蛋白A亲和层析和离子交换层析相结合的方法，提高了抗体的纯度。
2. 在实验过程中，注意控制流速、pH值等条件，以获得最佳分离效果。
3. 本实验结果可为抗体分离纯化提供参考，有助于提高抗体质量。
抗体纯化
抗体的初步纯化与鉴定实验方案提要第三组：组长：曹婷组员：聂莉、许春燕、吴永琴、周姣一、实验主要内容1.兔抗人IgG抗体及鼠抗BSA抗体的初步纯化硫酸铵分级沉淀法一、材料与试剂配制1、硫酸铵饱和溶液将硫酸铵800g~850g 到 1 000ml H2O中加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH3H2O调pH至7.02、0.01mol/L pH7.4的PB液A液：0.10mol/L NaH2PO4液称NaH2PO4·2H2O 15.60g，加入H2O至1000.mlB液：0.10mol/L Na2HPO4液称Na2HPO4·12H2O 35.80g，加入H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。
3、1%BaCl2溶液:称取1gBaCl2溶于100ml水中即可4、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。
5、生理盐水：称取9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。
6、透析袋：孔径为4KD的透析袋操作步骤1、动物血清的取得（1. 取血后，37℃下，让血液凝固1 到2 小时（不加抗凝剂）；2. 4℃冰箱过夜（让血块固缩）；3. 当血清自然析出后，4℃，3000 r/ min，离心10 min，分离血清，弃去不溶物；4. 将血清移至于灭菌后的100ml的烧杯中，并且估计血清的体积）假设获得的血清的体积为20ml（若体积有变化则按此比例进行适当的改变）向20ml血清中，加生理盐水20ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。
2、将静置好的溶液置于50ml的离心管中，离心，3000r/min，20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白,并且获得上清液，将上清液置于100ml的烧杯中。
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平衡
至洗脱峰回到基线后，使用上样缓冲液 平衡柱子
电泳鉴定
采用SDS 不连续丙烯酰胺凝胶电泳
层析图及电泳结果
AKTA蛋白纯化系统
AKTA主要是根据电导率的不同级盐浓度 的不同来洗脱不同的物质。系统主要分为 两部分，分别是检测系统和层析柱，根据 洗脱的不同的ph值来确定洗脱的物质是什 么。当然全自动的AKTA系统可以多柱， 多样品，多缓冲液，多组份检测，其检测 功能包括多波长紫外/可见光、电导、pH、 压力、温度、等等。功能很强大。
• Protein G G蛋白是一种源自链球菌G族的细胞表 面蛋白，一种三型Fc受体。其通过类似于A 蛋白的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像A 蛋白一样，G蛋白与IgG 的Fc 区域特异性结 合，不同的是，Protein G Sepharose 还可以 特异性低亲和地与重链的CH1及轻链的Cκ 结 合而用于纯化Fab 及F(ab’)2。另外，ProteinG 可以广泛、更强地结合许多类型的IgG，多 克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更 低，纯度更高，配体脱落也相对更低。
MabSelect 系列——大规模抗体 纯化亲和层析介质
• MabSelect 是一系列最新的大规模纯化抗体 的亲和层析介质。它们的特点包括： 1. 更高的流速和动态载量 2. 更低的宿主杂蛋白吸附，抗体纯度更高 3. 更低的蛋白A脱落 4. 更易于工艺的线性放大 5.MabSelect易于清洗与除菌，寿命更长、更 经济 6. 生产过程无动物血清成分
抗体的纯化和检测•抗体的纯化• Nhomakorabea体的检测
怎么纯化我们想要的抗体？
常见单抗的结构、种类、性质
单抗特性及纯化策略
每个单抗等电点、电荷密度、疏水性、糖 基化程度等生化性质各不相同。选择单抗 的纯化方法，既要了解他们的共性，又要 了解个性，从而制定相应的纯化策略(下 表 3)。
#抗体的纯化#
纯化步骤
样品预处理
出去杂质
10000r，30min 离心
破碎沉淀细胞
保留上清液
抗体在里边
加入饱和SAS （1:1）
盐析蛋白
搅拌过夜（4度）
充分沉淀蛋白
沉淀
10000r，30min， 离心 弃上清 液
沉淀蛋白
蛋白成分：抗体，极少 量杂蛋白，SAS
PBS溶液
溶解
叠氮钠
沉淀
离心
透析袋
3-6个小时更换一次透析 缓冲液（24-48h）
水化膜
蛋白质溶液
强
弱
溶解度
这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。 硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变 性而被广泛应用。
2， 操作步骤
• 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的 硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所 需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用 来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% • （一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 根据样品中的蛋白质的含量以及种类的 配制饱和浓度的硫酸铵溶液来沉淀样品中的 大多数蛋白质。当然这一步也有利于后边的 层析。
#抗体的纯化#
抗体 纯化的步骤
#抗体的纯化#
饱和硫酸铵沉淀法
• 饱和硫酸氨分级沉淀法是从溶液中 分离蛋白质的常用方法。这是一种比较原 始，非特异性分离技术。
• 饱和硫酸氨沉淀法作为抗体纯化的第一步 ,难以得到高纯度的抗体。但是它能够浓 缩和出去大部分的蛋白质，尤其是脂蛋白
基本原理
水分子 竞争 关系 盐离子溶液
重链
Protein A-Sep harose CL2-4B 亲 和层析柱分离提纯IgG
• Protein A--Sepharose CL24B 亲和层析法 的原理: A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地结 合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合力, 结合的强弱程度依次是: IgG2a > IgG2b > IgG3 > IgG1 。A 蛋白的这种结合也是具有p H 依 赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯化 与其结合较弱的IgG1。
Protein A/G亲和层析 亲和层析是一种快速有效的生物活性 物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对目的 蛋白选择性的吸收和分离,可取得较高的 纯化效果,且操作简便,广泛地应用于实 验室抗体纯化。由于产品价格昂贵,使用 成本较高,限制了它的运用。
• Protein A • A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
腹水处理 装柱 平衡
12000r，15min，去除大的凝 块 将Protein A-Sep harose CL-4B 干粉溶解, 再用p H 7. 4 的磷酸盐缓冲液 浸泡 15min ,然后装入层析柱中。 缓冲液平衡柱子，测ph=7.4
上样
洗脱
缓冲液稀释，滤膜过滤
用ph=4.0的柠檬酸溶液洗脱抗体，再用 ph=9.0的Tris-hcl缓冲液调节至7.0。应用A KTA explorer100 进行监测,当观察到基线 开始上升,即出现洗脱峰时,开始收集洗脱 液
CaptoAdhere
原理：Capto Adhere介质专为治疗用抗体的分离纯化 而设计，其配基 (N-Benzyl-N-methylethanolamine）综 合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方 式，因此对于抗体的聚集体具有非常独特而高效的 去除能力；此外，通过有效的实验设计 (Design of Experiment，DoE)，Capto Adhere 介质还可以同时有效去除泄漏的蛋白A配基、宿主 蛋白、核酸、内毒素和潜在的病毒。
Capto Adhere是一种流穿模式的纯化系统，能够将宿 主蛋白、脱落的蛋白A和聚集体降低到很低的水平， 载量可达100-200mg/ml介质，单步收率>90%。此外， Capto Adhere还具有很强的病毒去除的能力。
两步层析工艺
将Mabselect SuRe和Capto Adhere相结合进行两步层 析纯化。Mabselect SuRe可 以达到>99%的抗体纯度， 亲和洗脱峰使用 Captoadhere的流穿模式进 行精纯: 使抗体分子流穿而 聚集体、宿主蛋白、脱落 的蛋白A配基等杂质结合在 Adhere柱上加以去除。这 样仅用两步层析就可以得 到符合药用级质量要求的 高纯度抗体产品，大大缩 短了工艺时间，提高生产 效率，同时增加了收率， 降低了生产成本。