Sds-page电泳过程解析
sds-page蛋白电泳分析
实验二SDS－PAGE 蛋白电泳分析一、目的掌握 SDS-PAGE 电泳原理与方法二、电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
三、试剂配制1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。
加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。
2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。
sds-page电泳的基本原理
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过电泳分离蛋白质样品的方法得到了广泛的应用。
本文将着重介绍SDS-PAGE电泳的基本原理。
一、SDS-PAGE电泳的概念SDS-PAGE是一种已经被广泛应用的蛋白质分离技术，它的全称是聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。
这种电泳技术利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过直流电场将蛋白质样品分离出不同电荷和大小的蛋白质成分。
二、SDS-PAGE电泳的原理1. 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳中所使用的凝胶是由聚丙烯酰胺构成的。
聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，可以根据蛋白质的大小和电荷来调整孔隙的大小，从而实现不同大小的蛋白质的分离。
2. SDS处理SDS是指月桂基硫酸钠，它是一种阴离子表面活性剂。
在SDS-PAGE 电泳中，将样品中的蛋白质经过SDS处理后，蛋白质表面都会均匀地吸附一定数量的SDS分子，并且使蛋白质呈负电荷。
这样，所有的蛋白质分子都会带有类似的电荷密度，可以消除蛋白质的本身的电荷特性，使蛋白质在电场作用下只受到电场力的作用，而不受到其他因素干扰。
3. 蛋白质分离将经过SDS处理的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，然后通过电泳进行分离。
经电泳分离后，蛋白质会根据其大小和电荷迁移到不同位置，从而使不同的蛋白质分离开来。
三、SDS-PAGE电泳的应用SDS-PAGE电泳技术在生物化学和分子生物学研究领域应用广泛。
它可以用于研究蛋白质的分子量、纯度和比例，也可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，同时还可以用于鉴定蛋白质的异构体等。
四、SDS-PAGE电泳的发展SDS-PAGE电泳技术自问世以来，经过不断的改进和完善，在蛋白质分离和分析领域一直处于领先地位。
未来，随着科学技术的不断进步，SDS-PAGE电泳技术也将会迎来新的发展，并在更广泛的领域得到应用。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
Sds-page电泳过程解析
+ ※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平 稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.
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+ 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固 的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL 系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由 基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂， 作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分 子内的疏水作用、去多肽折叠。
4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝 胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4 度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般 凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料
5.技术参数 250V电压 浓缩胶使用15MA电流（每块胶），分离胶使 用30MA电流 电泳时间：在溴酚蓝跑到浓缩胶和分离胶交 界的地方调高电流继续电泳，等溴酚蓝跑的 玻璃板底部停止。
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6.制胶 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板. 按比例配好分离胶,用移液管快速加入
SDS-PAGE电泳的基础原理和试验步骤
SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤概述十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。
此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。
SDS-PAGE作用机理蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理（上样缓冲液）。
即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上缓冲液。
SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-（CH2）10-CH2OSO3-Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。
电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。
当样品上样并接通两极间电流后（电泳槽的上方为负极，下方为正极），在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。
样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8的上层，pH8.8的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。
出现了pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯>Pro¯>—COO¯。
SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
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一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
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蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
Rf= ————————— X ————————— 干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离
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2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
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3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
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3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较 高的平衡浓度。
SDS-PAGE-蛋白电泳分析
SDS－PAGE 蛋白电泳分析一、目的掌握SDS-PAGE 电泳原理与方法二、电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
三、试剂配制1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。
加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。
2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。
sds-page蛋白凝胶电泳原理
在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理的讨论之前，我们首先需要了解蛋白质和电泳技术的基本概念。
蛋白质是生物体内功能最丰富的大分子化合物，它们参与了生命的方方面面，包括结构、酶活性、信号传导等。
而电泳技术则是一种基于电场作用将带电粒子分离的方法，它在生命科学研究中有着广泛的应用。
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理是一种常用于分离和鉴定蛋白质的技术，其原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系。
现在让我们深入探讨SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的原理和相关细节。
1. SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的基本步骤在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，首先需要将待测样品中的蛋白质在含有SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液中进行变性处理，使得蛋白质呈线性结构并且带有负电荷。
之后，将处理过的蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并施加电场使得蛋白质开始迁移。
根据蛋白质的分子质量，它们将在凝胶中以不同的速率迁移，最终实现分离。
2. SDS的作用原理SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，它的主要作用是使得蛋白质呈线性构象，并且使得蛋白质的带电量与其分子质量成正比。
这样一来，不同分子质量的蛋白质在电场中受到的阻力相对应也会不同，从而实现蛋白质的分离。
3. 凝胶电泳的原理凝胶电泳是利用凝胶作为分离介质的电泳方法。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或者琼脂糖琼脂糖凝胶。
在SDS-PAGE蛋白凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶是最常用的分离介质。
它的基本原理是利用凝胶的孔隙大小来实现对蛋白质的分离，分子质量较大的蛋白质会受到较大的阻力从而迁移较慢，分子质量较小的蛋白质则会迁移得更快。
4. 电泳条件的影响在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，电泳条件的设定对分离结果有着重要影响。
电场强度的大小、电泳时间的长短、凝胶浓度等都会影响蛋白质的迁移速度和分离效果。
总结而言，SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系，通过SDS的作用使得蛋白质呈现线性构象并且带有负电荷，再利用凝胶电泳对不同分子质量的蛋白质进行分离。
sds page电泳原理
sds page电泳原理
SDS-PAGE电泳原理是利用电场将带有SDS（十二烷基硫酸钠）的蛋白质样品分离开来的一种技术。
该技术基于多肽链长度、电荷和形状的差异。
首先，将蛋白质样品与SDS热处理，在SDS存在下，蛋白质表面被均匀地磺
酸化并带有负电荷。
这使得所有蛋白质都具有相同的质量与电荷比比例，使得样品能够按照其分子量大小进行分离。
其次，通过将样品加载至聚丙烯酰胺凝胶中，形成一个蛋白质样品的平均浓度梯度。
然后，将电场应用在凝胶上，正负电极分别连接至凝胶两端，电场通过凝胶，使蛋白质样品向电极方向运动。
由于凝胶具有固体骨架结构，蛋白质在凝胶中的运动速度取决于其分子量。
较小的蛋白质能够更快地通过凝胶，而较大的蛋白质则移动较慢。
此外，通过在凝胶运行过程中添加精确分子量的分子量标准品，可以根据标准品与样品的迁移距离之间的关系，在凝胶上直接确定样品中蛋白质的分子量大小。
最后，电泳运行完成后，凝胶中的蛋白质样品可通过染色或其他检测方法进行可视化。
总结来说，SDS-PAGE电泳利用凝胶电泳原理将蛋白质样品按
照其分子量大小进行分离，通过对凝胶中的蛋白质进行染色或其他方法检测，可以分析蛋白质样品的组成和纯度。
SDS-PAGE解析
◇电荷效应：
。
蛋白质带负电荷，在电场中从阴极到阳极泳动
阴极
阳极
◇分子筛效应：
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。 SDS-PAGE仅根
据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质 。因为:
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内 和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结 构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的 二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚 成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束， 所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同 分子间的电荷差异和结构差异。[2]
1.7ml
0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25ml
100µ l 50µ l 10µ l
100µ l 100µ l 10µ l
3.制样及点样
将蛋白质样品与5X上样缓冲液混合后，在100℃水浴 中加热5-10分钟使蛋白质变性。10,000rpm离心1分钟， 取上清加样。 点样时，枪头垂直对准孔的中间，缓慢加样，移开 枪头时防止倒吸。加样时不得插伤凝胶孔胶面，不得 产生气泡、样品不得溢出加样孔。
• 样品蛋白质的相对泳动率：RA=0.175；RB =0.351 ；RC =0.196 ；RD =0.433；RE=0.505 。 (Rm=Dm/D) • 表1 标准蛋白的lgMW与Rm值 • a b c d e f • Rm 0.639 0.526 0.381 0.268 0.155 0.103 • lgMW 4.15 4.30 4.49 4.63 4.82 4.99 • 各条带对应的标准蛋白分子量的对数值与相对迁移率见表 1。根据表1，以标准分子量的对数值（lgMW）为横坐标 ，相对迁移率（Rm）为纵坐标，将标准蛋白质的坐标点 连为一条直线，即得标准曲线（图2），并根据此曲线得 趋势线公式：y= -0.1116x + 0.7359，由该公式计算出样 品蛋白质中各个条带相对应的蛋白质样品分子量对数值， 换算出分子量。
Sds-page电泳过程解析
+ ※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳 加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.
培训人：刘小强
1.实验目的
学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定
2.实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现
象称为电泳。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引
进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子 间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有 强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带 负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量 的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原 有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各 种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质 的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质 分子的迁移速度取决于分子大小。
+ 5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的 凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙 气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7. 为什么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品 促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 8. 为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE实验原理和操作步骤
S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳S D S P A G E实验原理和操作步骤The pony was revised in January 2021SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对 数的线性关系。
精品课件
（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质
稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作 用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的 选择对蛋白质的分离和电泳的速度是 非常关键的。
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 平板电泳
垂直电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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（4） 电泳 （5） 固定
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（6） 染色 考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue） ①R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含 有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑 一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。
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②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
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①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
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②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保
护SH基团，而得到窄的电泳带。
精品课件
③非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，
一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不需 要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白 并没有完全被去折叠。
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解SDS-（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种电泳技术，用于分离蛋白质。
它是目前最常用的蛋白质分离方法之一、以下将详细介绍SDS-的原理和操作步骤。
一、原理SDS-利用凝胶电泳原理，在电场作用下，将蛋白质按照其分子量大小分离。
其中SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是一种阴离子表面活性剂，它会使蛋白质解离成单个多聚体，并赋予了所有蛋白质相同的电荷密度，使其仅以分子量来分离。
此外，SDS还能够疏水化蛋白质，使其保持线性构象。
二、流程操作步骤1.制备凝胶：a.准备获得所需蛋白质分子量范围内的分离凝胶（通常为8-20%)和浓缩凝胶（通常为4%）。
b.根据实验需要，自制聚丙烯酰胺凝胶，或购买预铸凝胶片。
c. 使用缓冲液（常见的是Tris-HCl缓冲液）将凝胶片激活。
d.将激活的凝胶放在垂直电泳仓中，然后在最上层加入新鲜的蒽胺溶液以形成平整的上胶液面。
2.蛋白质样品处理：a. 将样品蛋白质进行还原处理，可以使用还原剂如β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）或二巯基甘油（dithiothreitol）。
b.加入相应体积的SDS缓冲液（含有SDS和甘油），将样品加热至100°C，以使其完全变性。
c.在样品中加入跟踪染色剂，常用的有溴酚蓝。
3.加载样品：a.打开电泳仓的盖子并插入试验板。
b.将样品架（通常是细长的注射器或者微量吸管）插入样品孔中，并缓慢地向内注入样品。
c.尽量确保样品的数量均匀，然后小心地将试验板放入电泳槽中。
4.电泳：a. 确保试验板完全浸没在含有缓冲液（如Tris-Glycine缓冲液）的电泳槽中。
b.调整电泳仓的参数，如电流和电压。
c.开启电源，运行电泳，直到跟踪染色剂移动到凝胶底部。
5.凝胶染色和成像：a.将凝胶从电泳槽中取出，并进行染色。
SDSPAGE原理和流程操作步骤详解
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蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS 胶束基本上是相同的 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比
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胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
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（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定
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3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形， 说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷 却不好
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（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起
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②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
SH基团，而得到窄的电泳带
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③非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一 般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不 需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋
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②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
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银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银
（银离子）还原成金属银，以使银颗 粒沉积在蛋白带上
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SDS-PAGE电泳实验原理及步骤
SDS-PAGE电泳实验原理及步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
基本原理SDS-PAGE是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,从而消除了蛋白质分子之间电荷差异。
实验步骤(1)将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。
放入100℃加热5-10min，离心取上清点样。
(2)将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干。
(3)组装好玻璃板：固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板。
(4)按表格1，根据要检测的蛋白的分子大小，选择相应的分离胶浓度，按表格2的配方进行配制。
配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。
注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。
(5)向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合。
水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。
凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。
(6)按表格3配制浓缩胶。
(7)将分离胶上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。
注意，样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。
(8)装好电泳系统，加入电极缓冲液，将样品梳拔去，上样。
上样前请确保锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果。
另外，上样过程中注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。
为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。
(9)稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 mi n～1hr. 最后，小心的将胶剥离玻璃板，进行下一步实验。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
sds-page凝胶电泳的方法
sds-page凝胶电泳的方法SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的蛋白质分析方法，广泛应用于生物化学、分子生物学和免疫学等领域。
本文将介绍SDS-PAGE凝胶电泳的原理、步骤及其在蛋白质分析中的应用。
一、SDS-PAGE凝胶电泳的原理SDS-PAGE凝胶电泳是一种基于蛋白质的分子量和电荷差异进行分离的方法。
其原理基于SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质的线性化和蛋白质的电荷密度。
在SDS-PAGE凝胶电泳中，首先将待分析的蛋白质样品与SDS混合，SDS能够以类似于肥皂的方式使蛋白质线性化，并赋予蛋白质一个负电荷。
这样，蛋白质在电场中迁移时，其迁移速度将仅与其分子量有关，而与其电荷无关。
二、SDS-PAGE凝胶电泳的步骤1. 制备凝胶：按照所需分辨率选择合适的凝胶百分比，常用的是8%至15%的聚丙烯酰胺凝胶。
将凝胶原液加入模具中，插入梳子，等待凝胶凝固。
2. 样品处理：将待分析的蛋白质样品与SDS样品缓冲剂混合，加热至95℃左右，使蛋白质线性化，并使其带负电荷。
3. 加载样品：将样品加载至凝胶孔中，注意不要过量加载，以避免样品溢出。
4. 进行电泳：将装有凝胶的电泳槽中加入电泳缓冲液，将电泳槽连接至电源，设定合适的电压和时间进行电泳。
5. 染色和成像：电泳结束后，取出凝胶，进行染色，常用的染色方法有银染和脱色共染方法。
然后，使用成像设备拍摄凝胶图像。
三、SDS-PAGE凝胶电泳的应用1. 分析蛋白质组成：SDS-PAGE凝胶电泳可用于分析复杂混合物中蛋白质的组成和相对含量。
通过凝胶电泳可以将不同分子量的蛋白质分离出来，并通过染色或质谱等方法进行进一步的鉴定和定量。
2. 确定蛋白质的分子量：SDS-PAGE凝胶电泳是一种常用的确定蛋白质分子量的方法。
通过与已知分子量的蛋白质标准品一同进行电泳，可以根据标准品的迁移距离与分子量的对应关系，推断待测蛋白质的分子量。
3. 检测蛋白质纯度：SDS-PAGE凝胶电泳可用于检测蛋白质样品的纯度。
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3.实验试剂 水：当天纯化水 A液： B液： C液：1%SDS(要配置成10%的母液) D液： E液： 10%AP: F液： TEMED 染色液：考马斯亮蓝（先用50ML的乙酸溶解再加甲醇和水） 脱色液：50ML的乙酸+200ML的甲醇+250ML水
4.器材 JUNYI-1600电源 BOI-RAD电泳槽
+ 5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的 凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙 气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7. 为什么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品 促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 8. 为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
+ 3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝 固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－ HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催 化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离 子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、 取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待 凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即 用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结 晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染 料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质 电泳技术手册》P82-103。
+ ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则 凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.
+ ※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳 加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.
7.样品处理
把样品稀释到合适浓度，按样品和样品缓冲 液3:1的比例加入
MARKER 10UL水+1ULMARKER+5UL还原 BAFFUR
沸水煮5分钟，离心8000RPM/5分钟，然后 上样
8.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃 板，将凝胶板做好标记后放在塑料盒内， 加入染色液，染色过夜。 脱色：染色后的凝胶，弃掉染色液，加入 脱色液在摇床上再脱色，直到蛋白质区带 清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充 分.
+ 12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要 是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽 液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。 13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔 梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而 致空气进入引起的。 14. 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？ 通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失 效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。 如果凝的太快， 可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 15. 电泳时间比正常要长？ 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被 分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。
+
+ 思考题：
+ 在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水, 为什么?
+ 电极缓冲液中甘氨酸的作用?
+ SDS-PAGE中样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/ 甘氨酸，电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量 的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其 中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯 离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电 场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白 和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在 移动界面附近，浓缩成一中间层。
+ 9. 什么是“鬼带”，如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶 端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀， 主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离 的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子 量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同 的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补 充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的 现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 11. 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确 （6.7）；适当降低电压；
培训人：刘小强
1.实验目的
学习SDS-PAGE测定蛋白质ห้องสมุดไป่ตู้子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定
2.实验原理 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现
象称为电泳。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引
进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子 间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使 半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有 强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带 负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量 的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原 有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各 种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质 的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质 分子的迁移速度取决于分子大小。
实验结果分析：凝胶成像系统
SDS-PAGE电泳过程中影响结果的因素： 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？
在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓 冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的 Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此 甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子 却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二 者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成 了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭 窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性， 甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时 由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固 有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除 其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
5.技术参数 250V电压 浓缩胶使用15MA电流（每块胶），分离胶使 用30MA电流 电泳时间：在溴酚蓝跑到浓缩胶和分离胶交界 的地方调高电流继续电泳，等溴酚蓝跑的玻璃 板底部停止。
6.制胶 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板. 按比例配好分离胶,用移液管快速加入
+ 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、 非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙 醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结 合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这 种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水 煮5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可 以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙 酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品 缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1 ％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏， 不可作为测定分子量来使用。
+
+ 在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和 AP,试述其作用?