耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的耐药机制及MALDI-TOF在碳青霉烯酶快速检测中的应用研究

耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的耐药机制及MALDI-TOF在碳青霉烯

酶快速检测中的应用研究

目的:研究不同人群分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）的耐药谱、CRE菌株对碳青霉烯类药物的耐药机制及其对磷霉素耐药的主要机制,应用MALDI-TOF建立产碳青霉烯酶菌株的快速检测方法,为临床的合理用药及医院感染的防控提供帮助。方法:1.收集我院2015年1月-2017年12月临床分离的CRE 菌株,使用全自动微生物分析系统进行常规药物的体外药敏实验,用纸片扩散法（K-B）检测头孢哌酮/舒巴坦和替加环素、琼脂稀释法检测磷霉素的体外药敏实验。

2.对227株CRE（其中166株肺炎克雷伯菌,29株大肠埃希菌,32株阴沟肠杆菌）进行PCR扩增耐药基因（包括碳青霉烯酶基因、ESBLs基因、AmpC基因及fos基因）和改良碳青霉烯酶灭活试验（mCIM）和EDTA抑制的碳青霉烯酶灭活试验（eCIM）。用脉冲场凝胶电泳试验（PFGE）检测CRKP菌株的DNA指纹图谱,分析菌株的同源性。

3.对fos基因阳性菌株进行质粒接合转移实验。对fos基因阴性的磷霉素耐药菌株进行碳源生长试验、用PCR扩增和测序技术对靶酶基因、转运体相关基因进行检测和比对分析;

4.收集我院2018年1月-2018年6月临床分离的74株CSKP 和前面收集的102株CPKP做质谱仪自建模型,利用MALDI-TOF质谱仪和ClinProTools3.0软件建立CPKP和CSKP的筛选模型,用于临床产酶菌株的快速筛查;

5.将CPKP菌株分别与不同浓度的亚胺培南和美罗培南共孵育,用

MALDI-TOF检测不同时间段内菌株对底物水解情况,摸索最佳条件。

结果:1.我院三年间共检出272株CRE,主要分离自痰液,其中成人组标本类

型前三位的是痰液、尿液和血液（分别占62.96%、20.83%和6.94%）,儿童组前三位则是痰液、血液和尿液（分别占50.00%、30.36%和10.71%）;成人CRE菌株主要来源于ICU（占40.82%）和神经外科（占13.43%）),儿童CRE菌株则主要来源于新生儿科（占30.35%）和呼吸内科（占17.86%）。CRE菌株对单环内酰胺类、头孢菌素类、β-内酰胺酶抑制剂复合物等抗菌药物均表现出高度耐药性,但成人组和儿童组对于氟喹诺酮类药物和氨基糖苷类药物的耐药率存在显著性差异,成人组耐药率基本在60%以上（仅阿米卡星为40.8%）,儿童组基本在40%以下。

2.227株CRE菌株中mCIM实验阳性193株,阳性率85.0%,其中eCIM实验阳性率30.4%;碳青霉烯酶基因的阳性率为8

3.7%（190/227）,其中146株携带

bla_KPC-2,47株携带bla_NDM-1,43株携带

bla_IMP-4,有14.5%的菌株同时携带两种碳青霉烯酶基因;87.2%的菌株携带ESBLs基因,以bla_TEM,bla_SHV和

bla_CTX-M-14为主;11.0%的菌株携带AmpC酶基因;共有76.2%的菌株同时携带碳青霉烯酶基因及其他耐药基因（ESBLs,AmpC酶基因）。部分菌株的PFGE电泳和同源性结果分析显示菌株间亲缘距离在0.8以下,亲缘关系较远,同源性较低。

3.227株CRE中有86株磷霉素耐药,耐药率37.9%,其中成人组75株耐药（耐药率41.2%）,儿童组11株（耐药率18.9%）;86株磷霉素耐药株中75株检出fos 基因（均为fosA3）,其中25株质粒结合成功,表明fosA3基因可通过可移动元件水平传播;11株（2株阴沟肠杆菌,9株肺炎克雷伯菌）未检测出fos基因;

4.11株fos基因阴性菌株的磷酸己糖转运系统（UhpT）功能正常。2株肺炎克雷伯菌

的甘油-3-磷酸转运系统（GlpT）功能正常,其余9株GlpT系统可能存在功能障碍。

2株阴沟肠杆菌均未扩增出MurA靶酶基因;9株肺炎克雷伯菌中有6株MurA 序列无突变,1株MurA序列存在单核苷酸插入,导致移码突变,提前终止翻译,还

有2株MurA序列存在氨基酸替换现象。在glpT基因序列分析中发现3株肺炎克雷伯菌该序列无改变,1株肺炎克雷伯菌的glpT基因中间存在插入一段IS5的序列,其他菌株的序列扩增失败。

pstI序列扩增分析发现存在较多的位点缺失突变或存在单核苷酸插入,致

翻译提前终止。11株菌的uhpT,uhpA和cyaA基因检测均未发现突变。

5.MALDI-TOF上建立的筛选模型在两组细菌间发现5个差异蛋白峰,验证实

验显示对CPKP分组的准确性为88.46%,对CSKP分组的准确性为72.5%;水解底物法实验中亚胺培南浓度为0.5g/L时,孵育30min组CPKP水解亚胺培南的水解率达98.61%,1h组水解率为100%;美罗培南浓度2mM孵育2h组水解率为90.28%,3h 组和4h组均为91.67%;结论:1.CRE菌株对常用抗菌药物呈现高度耐药,来源于成人组和儿童组的分离株在氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物的耐药率上存在显

著性差异,儿童组的菌株更敏感。CRE菌株对磷霉素和替加环素的耐药率较低,临床可以根据感染个体具体情况及药物适应症综合考虑,作为经验用药的备选药物。

2.CRE菌株多同时携带多种耐药基因,其中碳青霉烯酶基因以

bla_KPC-2为主,其次为bla_NDM-1和

bla_IMP-4。部分CRKP集中分离科室的菌株间亲缘关系较远,同源性较低,尚未发现克隆传播现象。

3.携带fosA3基因是我院CRE菌株对磷霉素耐药的主要原因,且fosA3基因

可通过可移动元件水平传播;4.fos基因阴性CRE菌株多存在靶酶改变和转运体功能障碍,其中阴沟肠杆菌存在靶酶缺失或构像改变,肺炎克雷伯菌主要是glpT 基因序列缺失和插入突变。但对于个别氨基酸突变是否导致靶酶改变、GlpT转运系统相关蛋白改变与磷霉素耐药之间关系需进一步分析。

5.基于MALDI-TOF MS建立的两种快速筛查方法中,自建模型法对CPKP的敏感性较好,对CSKP的区分有一定的假阳性;两种底物的水解酶法比较发

现,0.5g/L亚胺培南孵育30min的实验方案更适合临床应用。