农杆菌转化原理及技术 PPT

胚性愈伤
三、农杆菌介导转化水稻
❖ 1. 愈伤组织的预培养
❖ 选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒 状愈伤，转接到预培养培养基中，置于27℃暗培养 4天。
❖ 2.农杆菌的培养及处理
❖ 从低温（-85℃） 冻存管中刮取少量菌液于附加Kan50 mg·L-1和Rif50 mg·L-1YEB固体培养基划线，然后在28℃暗 培养36~72h进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌， 28℃培养两天后，用适量添加有100µM·L-1乙酰丁香酮（AS） 的AAM培养基将菌洗脱，悬浮于添加有100µM·L-1乙酰丁香 酮20 ml AAM培养基中，剧烈摇动1min后，调整菌液浓度至 OD600nm=1.5~2.0，静置1h，以便让农杆菌形成悬浮液。
❖ Vir区为30Kb,由 VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、VirH 等七个操纵子共24个基因起共调控作用。
Ti质粒结构示意图
农杆菌侵染过程
❖ 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;
❖ 这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和 virG 基因,再诱导Vir区的其他基因;
30-50 mg·L-1 ，pH 5.8-5.9。
❖ 5.分化培养基：NB+KT10mg·L-1+ NAA0.4 mg·L-1；pH 5.8-5.9。 ❖ 6.生根培养基：1/2MS ；pH 5.8-5.9。
二、胚性愈伤组织的诱导及继代
❖ 取水稻授粉后15-20d的未成熟穗，将未成熟种子 剥壳，用75%乙醇浸泡1min，再转入25％的次氯 酸钠溶液中振荡灭菌25min，于超净工作台中无 菌水冲洗3-5次，将消毒后种子的幼胚挑出并接种 于诱导培养基中，每皿约30粒，于28℃暗培养7d， 切除胚根，继续培养7d，待愈伤长大后进行继代 培养。从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用 于农杆菌转化。
❖ Vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移; ❖ T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上; ❖ T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素; ❖ 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因(ocs),该基
因启动合成各种酶,分解植物细胞产生的冠瘿碱作为惟一 的碳源和氮源;
❖ 冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti质粒的 接合转移,扩大侵染范围
根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基 因导入植物细胞并整合到核DNA上。
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
Biology of A. tumefaciens
Well known to induce crown gall tumor
A.tumefaciens lives around root surfaces (in rhizosphere) where it using nutrients that leak from the root tissues
❖ 根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒 （Ti质粒）。
❖ 根癌农杆菌的Ti质粒包括毒性区（Vir区）、结合区 （Con区）、复制起始区（Ori区）和T-DNA区四个部 分，其中与冠瘿瘤生成有关系的是Vir区和T-DNA区。
❖ T-DNA区左右边界各有25bp的重复序列，其中14bp是 核心，分10bp（CAGGAATATAT)和4bp（GTAA)不连 续的两组，是完全保守的。
Produce callus transform callus stimulate shooting by cytokinin addition
+ cytokinin
This procedure is easy for dicotyledone plants
(legumes etc)
Agroபைடு நூலகம்acterium tum efaciens
愈伤诱导
NB培养基为基 本培养基加入相 应植物生长调节
剂
共培养
整个操作过 程约需8天
第一天（预培养） 第三天（划菌） 第五天（侵染、共培养) 第八天（脱菌、筛选）
抗性愈伤的筛选与 再生成完整植株
技术关键：诱导与培养“状态良好”的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继 代次数不超过8代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效 去除农杆菌或者抑制农杆菌生长（合适的抗生素及其浓度）；快速筛选（2-3次 筛选）；迅速分化再生。
Ti plasm id w ith the new gene
+
cell’s DNA
A g ro b a cteriu m
Plant cell
Transform ation
The new gene
Transgenic plant
C ell division
农杆菌介导转化水稻的方法
水稻（籼稻）根癌农杆菌转化技术流程
infects only through wound sites and actively chemotactic to them
Bacterial T-plasmid produces receptors for acetosyringone
Plant wound produces acetosyringone
几种常用植物基因转化方法的比较
农杆菌介导法的优点
❖ 操作简便 ❖ 外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝 ❖ 转移DNA片段明确 ❖ 可转移大片段DNA ❖ 可直接用不同的植物组织进行基因转移
农杆菌介导遗传转化的原理
❖ 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为发根农杆菌 （导致毛状根的发生）和根癌农杆菌（导致冠瘿瘤， 冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱）。
一、 培养基
❖ 基本培养基为NB培养基，愈伤诱导、转化及分化等 培养基配方如下：
❖ 1.诱导培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 2.预培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 3.共培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 +AS100 µM·L-1 ；pH 5.2。 ❖ 4.选择培养基：NB+2,4-D 2mg·L-1 + 羧苄青霉素 250mg·L-1 + Hyg