SDS碱裂解法原理
碱裂解法质粒提取的原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,就是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。下面就是该法的提取原理:
碱法质粒抽提用到三种溶液:
溶液I,50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8、0;
溶液II,0、2 N NaOH / 1% SDS;
溶液III,3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用
任何生物化学反应,首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的与适当pH值的Tris-Cl溶液,就是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖就是干什么的呢？说起来不可思议,加了葡萄糖后最大的好处只就是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖就是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA就是Ca2+与Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用就是:抑制DNase的活性,与抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA,无非就就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA,其实也没什么大不了的,只要不磨洋工,只要就是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕DNA会迅速被降解,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天您手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢？实话告诉您,只要用等体积的水,或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的就是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。
溶液II的作用
这就是用新鲜的0、4 N的NaOH与2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH 稀释制备0、4N的NaOH,无非就是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要就是碱,而不就是SDS,所以才叫碱法抽提。事实上NaOH就是最佳的溶解细胞的试剂,不管就是大肠杆菌还就是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这就是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0、4 N NaOH,即便就是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌,自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒,因为SDS也就是碱性的,只就是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为就是为了让基因组DNA变性,以便沉淀,这就是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问,既然就是NaOH溶解的细胞,那为什么要加SDS呢？那就是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点:第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。
溶液III的作用
溶液III加入后就会有大量的沉淀,但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解就是,当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果您这样怀疑,往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液瞧瞧就知道不就是这么回事了。大量沉淀的出现,显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢,也会有少量的沉淀,但量上要少得多,显然就是盐析与酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不就是遇酸发生的沉淀,那会不会就是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl,您会发现SDS在高盐浓度下就是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果您加入的不就是NaCl而就是KCl,您会发现沉淀的量要多的多。这其实就是十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷
基硫酸钾(potassium dodecylsulfate, PDS),而PDS就是水不溶的,因此发生了沉淀。如此瞧来,溶液III加入后的沉淀实际上就是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴的就是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象,因为基因组DNA太长了,长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了,尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2 M的醋酸又就是为什么而加的呢？就是为了中与NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中与之。基因组DNA一旦发生断裂,只要就是50－100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为就是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了,这就是天大的误会,因为变性的也好复性的也好,DNA分子在中性溶液中都就是溶解的。NaOH本来就是为了溶解细胞而用的,DNA分子的变性其实就是个副产物,与它就是不就是沉淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置,目的就是为了PDS沉淀更充分一点。
酚/氯仿纯化
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了,其实还有很多蛋白质不能被沉淀,因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提,然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA,不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇就是有很多道理的,这里做个全面的介绍。酚(Phenol)对蛋白质的变性作用远大于氯仿,按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉,但就是水饱与酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液(比如4M的异硫氰酸胍),离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收;但加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收;还有一点,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应),因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除,而用酚/氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加,其作用主要就是为了让离心后上下层的界面更加清晰,也方便了水相的回收。
回收后的水相含有足够多的盐,因此只要加入2倍体积的乙醇,在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。这时候如果放到－20℃,时间一长反而会导致大量盐的沉淀,这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收,所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子,因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀,就用70％的乙醇多洗几次,每次在室温放置一个小时以上,并用tip将沉淀打碎,就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含RNase(50 ug/ml)的TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。
质粒检测
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时,多数情况下您能瞧到三条带,但千万不要认为您瞧到的就是超螺旋、线性与开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA,不信的话您用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳,就会瞧到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序,分别就是超螺旋、开环与复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。如果您不小心在溶液II加入后过度振荡,会有第四条带,这条带泳动得较慢,远离这三条带,就是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的就是,有时候抽提到的质粒会有7－10条带,这就是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致。
碱裂解法提取质粒-配方,操作说明
碱裂解法提取质粒 一、基本概念 1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。 目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI 或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄
SDS-碱裂解法原理
碱裂解法质粒提取的原理 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。下面是该法的提取原理: 碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。 溶液I的作用 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 溶液II的作用 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH 的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。 溶液III的作用 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二
碱裂解法提质粒原理详解
从质粒提取谈起 (2009-12-22 11:18:37) 转载 标 分类：积累小常识 签： 杂 谈 从质粒提取谈起 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的p H，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA.如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生
碱裂解法提取dna的方法
碱裂解法提取质粒DNA 实验目的 1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法； 2、了解制备原理及各种试剂的作用。 实验原理 碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH 值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。 一、材料 含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架，枪头及盒、卫生纸。 二、设备 微量移液器(20μl，200μl，1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱等。 三、试剂准备 1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。 2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。 3. 溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。 1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。 4. 溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。
碱裂解发制备质粒DNA原理
碱裂解发制备质粒DNA原理 试验原理： 碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺酸钠进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性（NaOH对细胞的裂解作用强于SDS）。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、pcr扩增、银染序列分析等。 各试剂的作用： 1、溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋和Mg2＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。 2、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1%的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4 N NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。 3、溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L.pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA 以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。 4、异丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1%左右，小分子所需PEG浓度高达20%。 5、无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA 以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。加入的乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。也可改用95%乙醇来替代无水乙醇。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。
质粒DNA提取方案(碱裂解法)
质粒提取原理 采用碱裂解法抽提质粒DNA是基于染色体DNA 与质粒DNA的变性与复性的差异不同而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开，DNA变性。质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，留在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA及蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 Solution I：葡萄糖可增加溶液的年度，维持渗透压，防止染色体DNA受机械剪切作用而被降解，污染质粒DNA；溶菌酶（可省略）水解菌体细胞壁的化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，具有溶菌的作用。当pH<8.0时，溶菌酶受到抑制；EDTA有两个作用：(1)螯合Mg2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解。 (2) EDTA的存在有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度环境；Tris-HCl作为缓冲溶液维持适当的浓度和pH值。 Solution II：NaOH，DNA在5.0
质粒DNA的提取碱裂解法
质粒DNA的提取（碱裂解法） 实验原理： 碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。 提取步骤： 1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心 2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥 2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬 浮。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率 3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万 不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。 4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒）， 使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀 5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL 离心管中 6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。 7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小 心将上清吸至新的 1.5mL离心管中 8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新 的 1.5mL离心管中
碱裂解提取质粒各个试剂作用
质粒提取试剂的原理 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液I：50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II：0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III： 3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以
碱裂解法原理
质粒抽提经典中的经典--从质粒抽提谈起 2007-4-10 22:22:32信息来源：来源网络 质粒抽提经典中的经典--从质粒抽提谈起 https://www.360docs.net/doc/5e11856507.html, 生物谷网站 复旦大学生化与分子生物学实验室教授撰写 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。 生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？ 可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。 每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tri s-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的p H，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术可是我收研究生十几年了,几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少追其原因,我想大概是因为分子克隆里面只讲实验操作步骤,而没有对原理进行详细的论述这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多,甚至有很多老师也是这个状态这就不得不让人感到悲哀了 我想这恐怕和我们的文化有点关系中国人崇尚读书,学而优则仕的观念深入人心经常听到的是父母对他们的独苗说,你只要专心读好书就可以了所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住,考试的时候能拿高分,这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因如果中国文化在这一点上不发生变化,那么科学是不能在中国真正扎根的,它只能蜕化成新的八股学生命科学是实验科学,它讲究动手如果实验科学只要看看书就可以了,那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了?或者听听体育老师的讲解就会滑冰了?可是光动手不思考,不就成了一个工匠?一个合格的生命科学研究者,需要在这两方面完善自己一个杰出的科学工作者,是一个熟知科学原理并善于应用的艺术家每个曾经用碱法抽提过质粒的同学,希望你看本文后能有所思考,让中国的未来有希望 为了方便理解,这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液: 溶液I,50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8.0; 溶液II,0.2 N NaOH / 1% SDS; 溶液III,3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸 让我们先来看看溶液I的作用任何生物化学反应,首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液,是再自然不过的了那么50 mM葡萄糖
碱裂解法抽提质粒DNA
实验一碱裂解法抽提质粒DNA [实验原理] 质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。 质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性），利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。 质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（ori）：一段具有特殊结构的DNA序列；（2）有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。制备质粒载体是分子生物学的常规技术。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 [实验目的] 1、掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。 2、掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。
碱裂解法
质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。 5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇） 7. 5×TBE：Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2?2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。 8．溴化乙锭（EB）：10mg/ml 9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。 10. 6×loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。 11. 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖于三角烧瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至终浓度0.5μg/ml（注意：EB为强诱变剂，操作时带手套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却30min以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液0.5×TBE），即可上样。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测 一、实验目的与原理简介 实验背景：质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。质粒作为载体应具备下列四个特点： ①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体 的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。 ②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易 于基因片段与载体的连接、重组与筛选。 ③与宿主细胞有相同一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色 表型反应等）。 ④拷贝数多，易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。 分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 实验原理：碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的。在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。 实验目的：提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA 的方法。 二．实验试剂
1，SolⅠ100ml：1M Tris-HCL（pH8.0）2.5ml，0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20%葡萄糖4.5ml( 葡萄糖单独灭，灭完后加入Sol I中)，高压灭菌，4°保存。 2，SolⅡ100ml：（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml，2M NaOH 50ml。使用前将两种溶液混合。 3，SolⅢ500ml：KAc 147g，HAc57.5ml，加300mlDDW搅拌，定容至500ml。高压灭菌，4°保存。 4，70%乙醇无菌水DDW 5，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 三、实验步骤 按1/100的比例接种保存的9K质粒大肠杆菌克隆菌种到3 mL的含有适当抗生素LB培养基，37℃、180rpm培养过夜或培养12小时以上，活化菌种(至对数生长期)。将活化的菌种按1/100接种至200 ml的LB培养基，37℃、250rpm 剧烈震荡培养过夜。 1、离心管（10mL）分装菌10ml，离心去上清（10000rpm，5min，4℃）；弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使液体尽可能流尽。 2、重悬于800μl 冰冷的SolⅠ中；剧烈震荡重悬菌体。 3、加入1.6mL SolⅡ轻轻颠倒数次（动作要轻柔，防止断裂DNA形成碎片），彻底混匀，室温放置10min（SolⅡ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 4、加入1.2mL冰冷的SolⅢ立即轻轻颠倒完全彻底混匀，冰上放置10min。 5、4℃，12000rpm离心10min。SolⅢ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。 6、收集上清至新的离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀,沉淀核酸，室温放置大于10min。12000rpm离心5min，小心移出上清于一新离心管中。 7、加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，离心12000rmp×10min。 8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5 min。 9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。 10、将沉淀溶于
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb~200kb以上不等。存在于细胞之中，独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成分。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的一种方法，它利用染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异来达到分离的目的。其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中（PH12.6）裂解时，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补连不会完全打开，当加入KAc（PH4.8）中和后，质粒DNA分子能够迅速复性，成溶解状态，离心时留在上清中，蛋白质与染色体DNA难于复性而成絮状，离心时可与细胞碎片一起沉淀下来。 试剂： 1.溶液I:50mmol/L 葡萄糖（使悬浮的大肠杆菌不会快速沉积到底部，其次调节渗透压） 25 mmol/L Tris.HCl (PH8.0) (缓冲体系) 10 mmol/L EDTA （PH8.0）(Ca离子、Mg离子等二价阳离子的螯合剂，抑制DNase 活性) 2.溶液II: 使用前临时配制 0.2 mmol/L NaOH (溶解细胞) 1% SDS （使细胞膜崩解） 与此同时，提高溶液PH，使染色体DNA、蛋白质及质粒均变性。 3.溶液III：100mL 5mol/LKAc 60mL (Na被K置换成十二烷基磺酸钾PDS，PDS结合蛋白质沉淀， 同时牵连染色体发生沉淀) 冰醋酸11.5 mL（中和NaOH，长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。 基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片 断，就没有办法再被PDS共沉淀了） ddH2O 28.5 mL 注意： ①NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几 乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。要新从浓NaOH稀释制备0.2M的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。 ②溶液II处理这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。 ③溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高
碱裂解法提取质粒：原理和注意事项
碱裂解法提取质粒：原理和注意事项
质粒提取之达人建议 碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。这就不得不让人感到悲哀了。 我想这恐怕和我们的文化有点关系。中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。生命科学是实验科学，它讲究动手。如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善
于应用的“艺术家”。每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。 为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。 让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化 [适用对象] 生物工程专业 [实验学时] 8学时 一、实验目的 使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。 二、实验原理 质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒在基因工程中是最常用的载体。提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA 会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 三、仪器设备 培养皿摇床天平高速离心机（×12000g）微量移液器（2－
20μl、20－200μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。 四、相关知识点 本课程知识点综合：涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。 多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。 五、实验步骤 细胞培养 接种培养 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。 离心 取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 细胞的裂解 悬浮细菌沉淀 将细菌沉淀重悬于100μl预冷的碱裂解溶液Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。（为确保细菌沉淀在碱裂解溶液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底互相接触同时涡旋振荡，可以提高细菌沉淀重悬的速度和效率。） 裂解细菌悬液 加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。 沉淀染色体和蛋白质 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮
质粒提取原理和方法
质粒DNA提取的原理及方法 碱裂解法质粒DNA提取原理 质粒DNA提取主要包括以下几个方面：如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。其原理是： 强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA 同时从细胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA 与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。 BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，
而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来，方法简单，快速，质量好，收获量高。 影响质粒提取的因素 影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数，宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。 质粒拷贝数 质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。BIOMIGA 公司质粒DNA 提取系列试剂盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。 下表给出一些常用质粒载体的拷贝数： 质粒种类 复制起点 拷贝数 1 mL菌液质粒DNA收获量(μg) pSC101
pSC101 5 pMB1 300-400 6-7 pBluescriptR ColE1 300-500 6-8 pUC Muted pMB1 500-700 8-12 宿主菌株 宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，如JM101, JM110, HB101, TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显着影响最终收获量，或者纯化到的质粒