SDS碱裂解法原理
SDS-碱裂解法原理
碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
溶液II的作用这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
碱裂解法质粒小量提取_文档
一碱裂解法质粒小量提取试验原理：碱裂解法是较常用的提取的方法。
其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。
十二烷基磺进行质粒的小量制备。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。
用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA 和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。
由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时，质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。
在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。
碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。
仪器与主要试剂主要试剂：溶液I：50 mmol/L葡萄糖10 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)溶液II：200 mmol/L NaOH 1% SDS溶液III：3 mol/L NaAc (pH4.8)溶液酚氯仿异丙醇（25：24：1）95%乙醇%70乙醇TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ,pH 7.5 1 mmol/L EDTARNaseA方法：1．将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16～18小时2．转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒3．小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀4．加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟5．加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次(可观察到溶液逐步由混浊变为透明)，冰上放置5分钟6．加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟7．12000rpm离心15分钟8．将上清转移到另一个EP管中(吸取时不可吸入底部的沉淀)。
SDS碱裂解法原理
SDS碱裂解法原理SDS碱裂解法是一种常用的蛋白质溶液处理方法，可以有效地将蛋白质分解为多肽和氨基酸片段。
它以十二烷基硫酸钠（SDS）为溶解剂和离子表面活性剂，利用其疏水性和高电荷密度，使蛋白质在溶液中呈现带负电荷的形式，从而对蛋白质进行粗化处理和裂解。
SDS是一种表面活性剂，它由疏水烷基链和亲水硫酸盐基团组成。
在水溶液中，SDS的烷基链部分会聚集在一起，形成一个疏水的烷基核。
而硫酸盐基团则向外靠拢，与水分子形成氢键，使整个分子呈肥皂状，也就是胶束。
在SDS碱裂解法中，蛋白质溶液被加入SDS缓冲溶液中，并在高温下进行加热。
SDS作为胶束结构的疏水核，可以结合到蛋白质的疏水性残基（如疏水性氨基酸，如苏氨酸、脯氨酸等），通过电荷作用力使蛋白质呈现部分解离的状态。
此时，SDS会插入到蛋白质的二级结构中，将其展开，破坏氢键和其他非共价交联，使蛋白质的整体结构变得松弛。
另外，SDS还具有一定的碱解作用。
在高碱条件下，SDS分子中的硫酸盐基团可以离解出一个负离子，从而形成一个更为疏水的碱性羰基离子。
碱性羰基离子可以与蛋白质中的氨基酸残基产生酰胺键的亲核取代反应，使蛋白质发生断裂并最终分解成多肽和氨基酸片段。
除了碱解作用，SDS碱裂解法中的高温加热也起着重要的作用。
高温可以提高反应速率，促进碱解反应的进行。
同时，高温还可以降低蛋白质的折叠状态，使其更易受到SDS的作用，实现蛋白质的粗化和裂解。
总的来说，SDS碱裂解法利用SDS的电荷作用和碱解作用，结合高温加热，将蛋白质分解为多肽和氨基酸片段。
这种方法在蛋白质研究领域广泛应用，例如蛋白质组学、蛋白质结构研究、蛋白质质谱分析等，为对蛋白质的研究提供了有效的手段。
碱裂解法提取质粒原理和注意事项
碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。
碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。
本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。
碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。
2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。
3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。
4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。
通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。
5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。
注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。
例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。
2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。
培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。
3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。
4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。
5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。
总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。
碱裂解法的原理
碱裂解法的原理碱裂解法是一种常用的化学分析方法，其原理是利用碱性溶液对样品中的化合物进行裂解，使其原子或离子形成溶液中的离子，从而实现化学分析。
碱裂解法的原理是基于化学反应的规律，即碱性溶液可以与许多化合物发生反应，将其分解成单质或离子。
这种反应通常是由于碱性溶液中含有氢氧根离子(OH-)，它们可以将水分子中的氢离子(H+)取代，形成氢氧根离子(HO-)，这种离子在碱性溶液中的浓度非常高，因此能够与样品中的化合物发生反应，将其转化为离子或单质。
碱裂解法的使用范围非常广泛，可以用于分析许多不同类型的样品，如金属、非金属、有机物、无机物等等。
其原理可以通过以下几个方面来解释：1. 碳酸盐类的裂解：碱性溶液可以将碳酸盐类物质裂解为二氧化碳和水，这种反应可以用于分析含碳酸盐的样品，如矿石、土壤等。
2. 金属氢氧化物的裂解：碱性溶液可以将金属氢氧化物分解为金属离子和氢氧根离子，这种反应可以用于分析含金属氢氧化物的样品，如金属盐、金属氢氧化物等。
3. 酸性氧化物的裂解：碱性溶液可以将酸性氧化物分解为氧化物和水，这种反应可以用于分析含酸性氧化物的样品，如硫酸、硝酸等。
4. 有机物的裂解：碱性溶液可以将有机物分解为离子或气体，这种反应可以用于分析含有机物的样品，如食品、药品等。
在进行碱裂解法分析时，需要选择合适的碱性溶液，并控制反应的温度、时间等参数，以确保反应的有效性和准确性。
此外，还需要对反应产物进行适当的处理和分离，以便进行后续的定量分析。
碱裂解法是一种常用的化学分析方法，其原理是利用碱性溶液对样品中的化合物进行裂解，将其分解为离子或单质，从而实现化学分析。
在进行分析时，需要选择合适的碱性溶液，并控制反应参数，以确保准确性和有效性。
碱裂解法提取质粒
碱裂解法抽提质粒原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，以下碱裂解法制备质粒的原理。
碱法质粒抽提用到三种溶液，溶液I：50 mM葡萄糖、25 mM Tris-Cl 、10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II：0.2 N NaOH、1% SDS；溶液III ：3 M 醋酸钾、2 M 醋酸。
1、溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。
加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
3、溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。
溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。
同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。
2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。
基因组DNA一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。
这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。
碱裂解法原理及步骤总结
碱裂解法原理及步骤总结碱裂解法是一种用碱性溶液将有机化合物切断成低分子量的碱式盐和碱相应的酸的方法。
主要适用于具有羧基、酰基、酮基或亚胺基等反应活性基团的有机化合物。
下面将对碱裂解法的原理及步骤做详细总结。
一、原理：碱裂解法通过与碱溶液反应将有机化合物的化学键切断，并生成碱式盐和碱相应的酸。
当有机化合物中存在可被碱性溶液中的碱捕获的反应活性基团时，碱裂解反应往往会发生。
碱裂解反应原理示例：RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O二、步骤：1.准备实验物质：将待反应的有机化合物准备好，以及所需的碱性溶液、溶剂等。
2.溶解有机化合物：将有机化合物溶解于适合的溶剂中，以便与碱性溶液充分反应。
3.加入碱性溶液：将溶解好的有机化合物溶液缓慢地滴加到已经准备好的碱性溶液中，同时进行搅拌。
4.调节反应条件：根据具体的化合物和反应条件要求，可以调节反应的温度、时间、pH等参数。
5.反应完成后处理：反应结束后，可以采取不同的方法进行处理，如中和、等温或冷却结晶、萃取等操作。
6.产物分离与收集：根据需求，可将产物进行分离和收集，如过滤、蒸馏、提取等操作。
7.产物液相分析：对分离和收集的产物进行液相分析，可采用纸层析、薄层色谱等方法进行验证和鉴定。
8.产物固相分析：对于产物为固体的情况，可采用质谱、红外光谱等方法进行分析。
9.结果记录与总结：将实验结果进行记录，并进行总结和分析。
10.实验后处理：对实验设备进行清洗和消毒，将废弃物进行妥善处理。
总结：碱裂解法是通过碱性溶液将有机化合物的化学键切断，生成碱式盐和碱相应的酸的方法。
其原理是有机化合物中存在的反应活性基团与碱性溶液反应，从而发生裂解反应。
具体的步骤包括溶解有机化合物、加入碱性溶液、调节反应条件、处理反应产物、分离和收集产物、分析产物等。
碱裂解法在有机合成中具有重要的意义，常用于合成具有特定功能的有机化合物。
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 8学时一、实验目的使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。
二、实验原理质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。
它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在基因工程中是最常用的载体。
提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。
提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA 会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、仪器设备培养皿摇床天平高速离心机（×12000g）微量移液器（2－20μl、20－200μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。
四、相关知识点本课程知识点综合：涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。
多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。
五、实验步骤细胞培养接种培养挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
离心取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
碱裂解法抽提质粒的原理
碱裂解法抽提质粒的原理SDS碱裂解法制备质粒DNA的原理：细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。
1．试剂（1）溶液Ⅰ：Tris-HCL（pH8.0）25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖50mmol/L,溶菌酶（临用时加）5mg/ml（2）溶液Ⅱ（新鲜配制）：NaOH 0.2mol/L,SDS 1﹪(W/V)（3）溶液Ⅲ（100ml）：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml(pH4.8),水28.5ml（4）酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）（5）无水乙醇和70﹪乙醇（6）无DNA酶的胰RNA酶（7）TE2．实验流程（1）挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml 含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37℃剧烈震摇下培养过夜。
（2）将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4℃以5000g离心5分钟（两次），将剩余的培养物贮存于4℃。
（3）吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（4）将细菌沉淀重悬于100μl溶液Ⅰ中，剧烈振荡。
注：溶菌酶促使大肠杆菌细胞变得脆弱而易于裂解。
溶菌酶对反应液的pH有很大的依赖关系，当其低于8.0时，细胞裂解的效果就大为逊色。
因此，溶液Ⅰ不仅使用了Tris-HCL缓冲体系，同时好加入了适量的葡萄糖而有利于pH的调节。
乙二胺四乙酸（EDTA）因其是二价金属离子（如Mg2＋等）的螯合剂，故少量地存在便可抑制核酸酶的活性，从而保护质粒DNA免被降解。
（5）加200μl溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触。
注意不要振荡。
将离心管放置于冰上5分钟。
注：SDS的作用在于使细胞裂解，以释放出质粒及染色体的DNA。
sds裂解细胞原理
sds裂解细胞原理SDS裂解细胞原理SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子表面活性剂，具有良好的蛋白质溶解和分离性能。
SDS裂解细胞是一种常用的方法，用于提取细胞内的蛋白质。
本文将详细介绍SDS裂解细胞的原理。
一、SDS的化学结构及作用机理1. SDS的化学结构SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子表面活性剂，其化学式为C12H25NaO4S。
它由一个长链烷基和一个亲水性羧基组成，烷基部分为十二烷基（C12H25），羧基部分为SO4Na。
2. SDS的作用机理SDS在水溶液中形成单分子层，并且与水分子形成氢键，使得其亲水性羧基向外，疏水性烷基向内。
当SDS与蛋白质相互作用时，其亲水性羧基与蛋白质中的极性氨基酸残基（如谷氨酸、天冬氨酸等）形成静电相互作用，同时，SDS的疏水性烷基则与蛋白质中的非极性氨基酸残基（如丙氨酸、苯丙氨酸等）相互作用。
这种作用机理称为“疏水作用”。
二、SDS裂解细胞原理1. 细胞膜的结构细胞膜是由磷脂双层和蛋白质组成的。
其中，磷脂是由两个亲水性头部和一个疏水性尾部组成。
在生物体内，磷脂双层呈现出液晶状态，使得细胞膜具有半透性。
2. SDS裂解细胞的过程SDS裂解细胞是一种常用的方法，用于提取细胞内的蛋白质。
其原理是利用SDS分子对于疏水性的亲和力将细胞膜溶解掉，从而释放出细胞内部的蛋白质。
具体来说，将待处理的样品加入含有SDS和还原剂（如β-巯基乙醇）的缓冲液中，并加以震荡或超声处理。
在这个过程中，SDS分子会穿过细胞膜，与磷脂双层中的磷脂头部相互作用，将其分解开来。
此时，SDS分子会包裹住蛋白质，并将其溶解在缓冲液中。
还原剂的作用是使得蛋白质中的二硫键断裂，从而使得蛋白质变为线性构象。
三、SDS裂解细胞的优点和缺点1. 优点(1) SDS裂解细胞方法简单、快速、高效。
(2) SDS可以将细胞膜溶解掉，从而释放出大量的细胞内部蛋白质。
(3) SDS可以将蛋白质变为线性构象，便于进行电泳分析。
sds裂解法
SDS裂解法是一种将高分子化合物（如聚合物）分解成低分子化合物的方法。
SDS是十二烷基硫酸钠的缩写，它是一种表面活性剂，可以在水和有机溶剂中形成胶束。
在SDS裂解法中，高分子化合物与SDS混合并加入水或有机溶剂中，形成胶束。
胶束中的SDS分子可以与高分子化合物中的极性基团（如羟基、羧基等）形成氢键和范德华力，从而稳定胶束。
接着，通过加热或加入酸性物质等方式，使胶束破裂，高分子化合物被分解成低分子化合物。
分解产物可以通过分离和纯化技术进行收集和处理SDS裂解法可以用于制备高分子化合物的单体、低聚物或聚合物的结构分析、表征和改性等方面。
它是一种简单、快速、高效的高分子化合物分解方法，被广泛应用于化学、生物、材料等领域。
sds碱裂解法制备质粒dna
sds碱裂解法制备质粒dna
SDS碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
该方法利用定量的SDS和NaOH对细菌细胞进行裂解，使DNA迅速释放。
接着，加入适当的中和缓冲液，使DNA回复其天然形态，并去除蛋白质等污染物。
最后，通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
以下是该方法的具体步骤：
1.生长细菌
生长适量细菌菌株并收获细菌：可以选择不同种类、不同来源、不同
体积得到不同量的细菌。
2.裂解细胞壁
将细菌沉淀后加入缓冲液和SDS混合。
SDS能够破坏细菌的细胞膜，使细胞壁裂解，从而将DNA释放出来。
3.中和
加入NaOH将溶液pH值升高至12，使DNA形状发生改变，变得易于析出。
接着，加入Tris-HCl中和缓冲液降低pH值，恢复DNA天
然形态，并使DNA强度不受影响。
4.去除杂质
通过高速离心将DNA沉淀下来，将上清液与DNA分离。
可以采用氯仿提取法以去除蛋白质和其他杂质，专用的富集试剂和离心柱可做更细致的纯化。
5.精华DNA
通过酒精沉淀法或硅胶柱层析法纯化DNA。
酒精沉淀法适用于大量DNA纯化，但对于大片段、GC富集的DNA适用。
硅胶柱层析法适用于小规模、高质量、片段少的DNA纯化，但成本稍高，操作复杂。
总之，SDS碱裂解法是一种快速，简单的质粒DNA提取方法。
由于其便捷的操作和高质量的DNA回收率，它已被广泛应用于基因工程和分子生物学等领域。
质粒DNA提取实验（SDS碱裂解法试剂盒法）原理步骤及注意事项
质粒DNA提取实验（SDS碱裂解法试剂盒法）原理步骤及注意事项实验方法原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
实验材料菌液试剂、试剂盒质粒抽提试剂盒RNase ABuffer S1Buffer S2Buffer S3Buffer W1Buffer W2 concentrateEluent仪器、耗材DNA 制备管离心管移液枪枪头枪头盒离心机实验步骤一、试剂盒组成、贮存、稳定性耗材：DNA 制备管，2 ml 离心管，1.5 ml 离心管。
RNase A：50 mg/ml，室温保存。
Buffer S1：细菌悬浮液。
加入RNase A 后，4°C 贮存。
Buffer S2：细菌裂解液，室温密闭贮存。
(若出现沉淀，应于37°C 温浴溶解并冷却至室温后再使用。
）Buffer S3：中和液，室温密闭贮存。
Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液。
使用前，根据瓶上数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。
可用100%乙醇或95%乙醇。
Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。
碱变性裂解法实验报告
一、实验目的1. 掌握碱变性裂解法提取质粒DNA的原理及操作步骤。
2. 学习利用碱变性裂解法提取质粒DNA，并对其纯度和浓度进行测定。
二、实验原理碱变性裂解法是提取质粒DNA的一种常用方法，其原理是利用碱处理使细胞裂解，染色体DNA和质粒DNA变性，再通过离心分离，使质粒DNA与染色体DNA和其他杂质分离。
在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
但由于质粒DNA的拓扑结构不同，其两条互补链在变性后仍保持缠绕状态，而染色体DNA则完全变性，形成缠连的网状结构。
在酸性条件下，变性的质粒DNA恢复原来的构型，而染色体DNA则无法复性，从而实现两者的分离。
三、实验材料1. 大肠杆菌菌种：含有目的质粒的菌株。
2. LB液体培养基：含有抗生素的培养基。
3. 主要试剂：- 溶液I：50 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、2 mg/mL溶菌酶。
- 溶液II：200 mmol/L NaOH、1% SDS。
- 溶液III：3 mol/L NaAc（pH 4.8）。
- 溶液TE：10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5、1 mmol/L EDTA。
- 乙醇：无水乙醇。
- 氯化钠：分析纯。
- 0.1 mol/L NaOH溶液。
4. 仪器：- 恒温振荡培养箱。
- 高速冷冻离心机。
- 漩涡振荡器。
- 离心管。
- 移液器。
- 离心管盖。
- 滤纸。
四、实验步骤1. 将大肠杆菌菌落接种在含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
2. 将培养好的菌液转移至EP管中，8000 rpm离心30秒，弃上清。
3. 向沉淀中加入溶液I，振荡混匀，室温放置5分钟。
4. 加入溶液II，混匀，室温放置5分钟。
5. 将混合液转移至新的EP管中，8000 rpm离心5分钟，弃上清。
6. 向沉淀中加入溶液III，混匀，室温放置10分钟。
7. 将混合液转移至新的EP管中，8000 rpm离心10分钟，弃上清。
碱裂解法小量提取质粒DNA
碱裂解法小量提取质粒DNA碱裂解法小量提取质粒DNA一、【实验原理】碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们，E.Coli染色体约4700Kb，SDS 是一种阴离子表面活性剂，它和NaOH共同作用既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来，基因组DNA断裂为线性双链片段，而质粒DNA仍为超螺旋，释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性，基因组DNA全部完全变性，而质粒DNA只有部分变性，然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA为小分子，两条互补链复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等通过离心一起沉淀下来而被除去。
然后通过苯酚、氯仿等抽提蛋白，2倍体积无水乙醇或0.6倍体积异丙醇沉淀DNA，70％酒精洗后，干燥，用无菌的双蒸水或TE溶解，－20℃保存。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷在电场中向正极移动。
由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。
如上次实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，（open circular DNA, 简称OCDNA）,线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂，（linear DNA，简称L DNA）。
碱裂解法提取基因组dna的原理
碱裂解法提取基因组dna的原理
碱裂解法是一种用于提取基因组DNA的方法。
其原理是通过碱性条件下，破坏微生物细胞壁和膜，使得DNA从胞内中释放出来，加入酸性物质后使得DNA质粒被还原为单股线形式，最终形成可溶于水的DNA溶液。
具体步骤如下：
细菌分离：利用细菌分离技术，将菌落分离出来，得到单一种类的细菌样品。
细胞收集：将细菌样品转移到离心管中，并进行离心来收集细胞。
碱裂解：使用含有NaOH和SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液，对细胞进行碱裂解，破坏细胞壁和膜，并释放DNA进入溶液中。
中和：加入氢氯酸（HCl）中和反应液，使溶液变为酸性。
沉淀：将反应液中的DNA沉淀出来，用乙醇洗涤、干燥等步骤进行纯化。
重溶：添加缓冲液或去离子水等溶剂，将DNA溶解于液体中，得到基因组DNA。
碱裂解法提取基因组DNA具有操作简单、适用范围广、获得的DNA量大等优点。
由于该方法不需要特殊的设备和试剂，被广泛应用于微生物基因组研究领域中。
碱裂解法原理及步骤总结
实验原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。
该方法提取质粒DNA是基于
线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的的。
在pH12.0~ 12.5的碱性条件下,染色体线性DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开;共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。
当pH调至中性并在高盐及低温条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,质粒DNA留在上清中,然后用有机溶剂酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA
●是基于线性染色体DNA与共价闭环质粒DNA在拓扑学上的差异而达到分离目的
●在pH12.0~12.5的碱性条件下
●细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋
结构被破坏而发生变性。
●共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态
●pH调至中性并在高盐条件下,大部分染色体DNA、大分子量RNA和蛋白质在去污剂SDS
的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍为可溶状态
三种溶液
平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大
量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了
醋酸：
是为了中和NaOH
75%酒精：
主要是清洗盐份和抑制Dnase；同时溶液III的强
酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上
步骤
具体步骤参见对应试剂盒
DNA提取基本步骤：
●材料准备
●破碎细胞或包膜——内容物释放
●核酸分离纯化
●沉淀或吸附核酸,并去除杂质
●溶解核酸于缓冲液或水中。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA二、实验原理先以低速离心从培养液中收集菌体，带有质粒的细菌经EDTA破坏外膜后，由溶菌酶破坏细胞壁的糖肽层再经去垢剂SDS变性作用，使细胞膜蛋白质变性崩解而使胞内DNA全部释放出来。
利用染色体DNA与质粒DNA在强碱条件下变性与复性的差异分离质粒DNA。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液将pH值调节至中性时，变性的质粒DNA 会恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。
用等体积饱和酚或氯仿使沉淀变性的蛋白质和染色体分离，再用乙醇沉淀上清液中的质粒DNA。
②氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
③溶液I(pH8.0)：终浓度需称/量取葡萄糖 50mmol/L； C6H12O6.H2O 1.982 gEDTA 10mmol/L； 0.5mol/L 4 mLTris-HCl（PH8.0） 25mmol/L； 1mol/L 5 mL 加DDW定容至200ml，高压灭菌后于4℃保存备用。
④溶液II(pH12.5)：NaOH 0.4mol/L；称取1.6g，加DDW定容至100mlSDS 2%（W/V）；称取2.0g，加DDW定容至100ml室温存放，临用时将二者对半混匀即可。
⑤溶液Ⅲ(pH4.8)：100ml5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5mlDDW 28.5ml高压灭菌后于4℃保存备用。
⑥TE(pH8.0)：Tris-HCl（PH8.0） 10mmol/LEDTA（PH8.0） 1mmol/L⑦TE+R:1mlTE+5ulRNase⑧溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl (pH8.0)溶液配制成10mg/ml，并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃⑨ 3mol/ L NaAc (pH5.2)：50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。
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碱裂解法质粒提取的原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,就是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面就是该法的提取原理:
碱法质粒抽提用到三种溶液:
溶液I,50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8、0;
溶液II,0、2 N NaOH / 1% SDS;
溶液III,3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
溶液I的作用
任何生物化学反应,首先要控制好溶液的pH,因此用适当浓度的与适当pH值的Tris-Cl溶液,就是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖就是干什么的呢？说起来不可思议,加了葡萄糖后最大的好处只就是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此,如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖就是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA就是Ca2+与Mg2+等二价金属离子的螯合剂,配在分子生物学试剂中的主要作用就是:抑制DNase的活性,与抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA,无非就就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA,其实也没什么大不了的,只要不磨洋工,只要就是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕DNA会迅速被降解,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天您手上正好缺了溶液I,可不可以抽提质粒呢？实话告诉您,只要用等体积的水,或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的就是,菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。
溶液II的作用
这就是用新鲜的0、4 N的NaOH与2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH 稀释制备0、4N的NaOH,无非就是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
其实破细胞的主要就是碱,而不就是SDS,所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH就是最佳的溶解细胞的试剂,不管就是大肠杆菌还就是哺乳动物细胞,碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解,这就是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0、4 N NaOH,即便就是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌,自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒,因为SDS也就是碱性的,只就是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为就是为了让基因组DNA变性,以便沉淀,这就是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问,既然就是NaOH溶解的细胞,那为什么要加SDS呢？那就是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点:第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦。
溶液III的作用
溶液III加入后就会有大量的沉淀,但大部分人却不明白这沉淀的本质。
最容易产生的误解就是,当SDS碰到酸性后发生的沉淀。
如果您这样怀疑,往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液瞧瞧就知道不就是这么回事了。
大量沉淀的出现,显然与SDS的加入有关系。
如果在溶液II中不加SDS会怎样呢,也会有少量的沉淀,但量上要少得多,显然就是盐析与酸变性沉淀出来的蛋白质。
既然SDS不就是遇酸发生的沉淀,那会不会就是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl,您会发现SDS在高盐浓度下就是会产生沉淀的。
因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。
但如果您加入的不就是NaCl而就是KCl,您会发现沉淀的量要多的多。
这其实就是十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷
基硫酸钾(potassium dodecylsulfate, PDS),而PDS就是水不溶的,因此发生了沉淀。
如此瞧来,溶液III加入后的沉淀实际上就是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全。
大家知道SDS专门喜欢与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,让人高兴的就是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
这个过程不难想象,因为基因组DNA太长了,长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了,尽管SDS并不与DNA分子结合。
那么2 M的醋酸又就是为什么而加的呢？就是为了中与NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中与之。
基因组DNA一旦发生断裂,只要就是50－100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了。
所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
很多人误认为就是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了,这就是天大的误会,因为变性的也好复性的也好,DNA分子在中性溶液中都就是溶解的。
NaOH本来就是为了溶解细胞而用的,DNA分子的变性其实就是个副产物,与它就是不就是沉淀下来其实没有关系。
溶液III加入并混合均匀后在冰上放置,目的就是为了PDS沉淀更充分一点。
酚/氯仿纯化
不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了,其实还有很多蛋白质不能被沉淀,因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提,然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA,不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解。
这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇就是有很多道理的,这里做个全面的介绍。
酚(Phenol)对蛋白质的变性作用远大于氯仿,按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉,但就是水饱与酚的比重略比水重,碰到高浓度的盐溶液(比如4M的异硫氰酸胍),离心后酚相会跑到上层,不利于含质粒的水相的回收;但加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收;还有一点,酚与水有很大的互溶性,如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中,而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应),因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除,而用酚/氯仿的混合液进行抽提,跑到水相中的酚则少得多,微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。
至于异戊醇的添加,其作用主要就是为了让离心后上下层的界面更加清晰,也方便了水相的回收。
回收后的水相含有足够多的盐,因此只要加入2倍体积的乙醇,在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来。
这时候如果放到－20℃,时间一长反而会导致大量盐的沉淀,这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收,所以不要过分小心了。
高浓度的盐会水合大量的水分子,因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果感觉发生了盐的沉淀,就用70％的乙醇多洗几次,每次在室温放置一个小时以上,并用tip将沉淀打碎,就能得到好的样品。
得到的质粒样品一般用含RNase(50 ug/ml)的TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。
质粒检测
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时,多数情况下您能瞧到三条带,但千万不要认为您瞧到的就是超螺旋、线性与开环这三条带。
碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA,不信的话您用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳,就会瞧到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。
其实这三条带以电泳速度的快慢而排序,分别就是超螺旋、开环与复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。
如果您不小心在溶液II加入后过度振荡,会有第四条带,这条带泳动得较慢,远离这三条带,就是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
非常偶然的就是,有时候抽提到的质粒会有7－10条带,这就是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致。