第五章分子荧光分析法
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第5章 荧光分析法与化学发光分析法
散射光的影响
瑞利散射光
拉曼散射光
干扰荧光测定，应采取措施消除
30
硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱
31
5.1.3
荧光分光光度计
32
1. 激发光源
高压氙灯 ——强谱线的连续光谱
连续分布在250-700nm波长范围内，尤其是300-400nm波 长之间的谱线强度几乎相等
汞灯 ——线光谱
高压：近紫外区365nm,398nm，405nm，436nm，546nm，579nm 低压:紫外区，最强254nm
－Cl、－Br、－I等
第三类取代基：－R、－SO3H、－NH3＋等
23
3．影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 pH值的影响
荧光熄灭剂的影响
散射光的干扰
24
温度和溶剂
温度：温度升高，荧光物质的荧光效率 和荧光强度下降 溶剂：溶剂极性增大，荧光波长随着而 长移，荧光强度增强；溶剂粘度减小， 荧光强度减小
化学发光分析主要用于定量分析。 1．化学发光强度与反应物浓度的关系
I Cl （t）＝ Cl dc A dt
55
2．常用发光试剂
（1）鲁米诺类 （2）光泽精类
（3）钌(Ⅱ)-联吡啶配合物
（4）其它化学发光试剂
56
5.2.5 应用与示例
1．无机化合物的分析 可以利用某些具有还原性的无 机阳离子和发光试剂作用对其进行测定；有些离子对 化学发光反应有增强或抑制作用，基于此，可直接测 定此类离子。此外，可利用置换偶合反应间接测定某 些离子。 2．有机化合物的分析 可以利用物质的还原性，直接 被氧化剂氧化发光测定。
51
3．液相化学发光
常用的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉 碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米 诺是最常用的发光试剂 。
分子荧光分析法
1.荧光效率
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
分子荧光分析法
实验技术
一、样品的制备 二、测定条件的选择
A、激发波长和发射波长的选择 B、狭缝宽度的选择
三、反应条件的选择
A、溶液酸度的选择 B、显色剂的浓度 C、温度的影响
分子荧光分光光度法的应用
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好，重现性好、方法 简捷以及取样量少等优点，使其越来越成为分析化学工作者 必需掌握的一种重要分析方法。另外仪器设备不复杂也是其 一大优点。
（b）、有机化合物的分析
医药卫生、环境保护、 农副产品质检等。
有机化合物的荧光分析是荧光分析法研究中最活跃、应用最广泛、 发展最有前途、涉及生命科学课题最多的分析法。
B、定量测定中的应用
分子荧光分析法可用于物质的常量、微量 以及痕量分析。
定量测定的依据：
定量分析常用的基本方法 1、标准对照法; 2、标准曲线法；
1. 打开荧光光度计和计算机，预热，对荧光光度计进行仪器初始化。 2. 选择测量参数。依次在不同的激发波长下扫描发射光谱，通过叠 加的谱图确定物质的荧光发射峰。最后确定最大发射波长值。 3. 在确定的最大发射波长下做激发光谱，测量物质的最大激发波长值。 4．记录四种物质的发射光谱和激发光谱，对它们 的荧光谱图进行比较分析。 5. 数据记录。
----苯环类物质的荧光光谱分析及定量测定
一、方法原理 二、分子荧光分光光度计 分子荧光分理
荧光的激发光谱和发射光谱
如果固定荧光的发射波长（即测定波长），而不断改变 激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度，所得 到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱（简称 激发光谱）。
如果使激发光的波长和强度保持不变，而不断改变荧光的 测定波长（即发射波长）并记录相应的荧光强度，所得到的 荧光强度对发射波长的谱图则为荧光的发射光谱(简称发射光 谱)。
第五章分子发光—荧光、磷光和化学发光法
2.化学发光效率
发射光子的分子数 cl ce em 参加反应的分子数
激发态分子数 化学效率： ce 参加反应分子数
发光效率：
em
产生光子数 激发态分子数
时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：
dc I cl t cl dt
dc/dt 分析物参加反应的速率；
目 录
5-1 荧光和磷光光谱法
5-1-1 5-1-2 5-1-3 5-1-4 基本原理 荧光分析仪器 荧光分析方法的特点与应用 磷光分析法
5-2 化学发光与生物发光分析法
5-1-1 基本原理
5-1-1-1 5-1-1-2 5-1-1-3 5-1-1-4 荧光和磷光的产生 光谱曲线 荧光的影响因素 荧光强度的定量关系
5-1-1-4 荧光强度的定量关系
根据Parker方程，荧光强度F与荧光物质的浓度c 之间的关系是：
F 2.3kI 0 Fcl[1 (2.3cl) / 2! (2.3cl) 2 / 3! ]
k 与仪器有关的常数
I0 激发光的强度 F 荧光量子产率 荧光物质在激发波长处的摩尔吸光系数 l 光程长度。
当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均 可忽略不计，Parker方程可简化为： F 2.3kI 0 Fcl F = Kc
5-1-2 荧光分析仪器
5-1-2-1 荧光分析仪器框图
光源
消除溶液中可能共存的其它 光线的干扰,以获得所需要 的荧光.
显示
激发光单色器
信号处理
I0
样品池 F 发射光单色器 (荧光单色器) 检测器
4.化学发光反应的类型
（1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
分子荧光分析
荧光光谱:固定激发光波长和强度，而让物质发出
的荧光通过单色器测定不同波长的荧光强度。以
荧光的波长〔λ〕为横坐标，荧光强度〔IF〕为
纵坐标作图，便得荧光光谱。
蒽的激发光谱和荧光光谱
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
影响荧光发光的因素
分子构造影响荧光发光
分子产生荧光的条件 ：
①物质必须具有能吸收一定频率紫外光的特定 构造；
NH3
NH2
NH
OH H
OH H
pH<2 无荧光
7~12 蓝色荧光
>13 无荧光
定量分析方法
校准曲线法：以量的标准物质，按试样一样 方法处理后，配成一系列不同浓度的标准
溶液1，.校在准仪器曲调线零法后：再以浓度最大的标准 溶后测液2出作.标其基准他准标，对准调照溶节法液荧:的光相强对度荧读光数强为度10和0；空然 白溶3液．的多相组对分荧混光合强物度；的扣荧除光空分白析值:后，
以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横 坐标，绘制标准曲线；然后将处理后的试 样配成一定浓度的溶液，在同一条件下测 定其相对荧光强度，扣除空白值后，从校 准曲线上求出其含量。
分子荧光分析法在医学检验中的应用
尿液中的色胺的测定
尿中色胺的含量是色氨酸代谢的 一个标志。色胺有天然荧光，激发峰 285nm，荧光峰360nm。把尿或组织液 的色胺萃取出来，就可直接检测。在 0.1~8μg/15mL范围内，荧光强度与色 胺浓度呈线性关系。
2 苯环上取代基的类型：
给电子基团。如-OH、-NH2常使荧光增强。
与π电子体系互相作用较小的取代基。如-SO3H对 分子荧光影响不明显。
吸电子基团如-COOH、-CO减弱甚至破坏荧光。
3 具有刚性平面构造的分子：
分子荧光分析法实验
4800
4200
3600
3000
C
2400
1800
1200
600
0 550 560 570 580 590 600 610 620
W avelen g th (n m )
（☆注意：在一定浓度范围内适用）
? 问题：
试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。
1.4 荧光仪的基本构造
？问题：荧光光度 计与紫外-可见分光 光度计在光路设置 上有什么不同？为 什么？
02
维生素Ｂ２（核黄素）在一定波长的激 发光照射下会发射出绿色荧光，根据荧 光强度在一定浓度范围内与荧光物质浓 度成正比，用标准曲线法对样品进行定 量分析，在线性良好的情况下，也可用 浓度直接读出被测样品的浓度。
2.2 实验流程
VB2的荧光 光谱的绘制
标准工作曲 线的制作
未知液的测 定
1.开机： 打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开关，开启
1.5 分子荧光分析法的应用简介
常规分析应用：
01
定性分析：φf；λex；λem；峰 形等
03
其它（略）
02
定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C
04
高端生化研究：
05
分子相互作用研究；
06
代谢动力学跟踪；
07
显微成像（物理迁移与化学衍化的 原位“显迹”）
二、维生素B2含量的荧光法测定
01 2.1 实验原理
5.空白溶液测试：
设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样架内， 在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计算机 屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近零时， 再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
第五章 分子发光分析法
s
体系间窜跃（ 不同多重态, 体系间窜跃（ isc ）：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐 射跃迁（ S1→T1跃迁 跃迁） 磷光发射：电子由第一激发三重态 射跃迁（ S1→T1跃迁） 。磷光发射：电子由第一激发三重态 的最低振动能级( =0)跃迁至基态各振动能级 跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁 跃迁）。 的最低振动能级(v=0)跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁）。 S2 Intersystem Crossing 系间窜跃 S1 磷光发射 Phosphorescence T1
第五章 分子发光分析法
基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态， 基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时 分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时， 便产生分子发光 分子发光（ 便产生分子发光（Molecular Luminescence）。 ）。 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、 荧光和磷光两种）、热致发 （按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、热致发 场致发光和化学发光等 光、场致发光和化学发光等。 本 分子荧光（Molecular Fluorescence）、 分子荧光（ ）、 章 分子磷光（ 分子磷光（Molecular Phosphorescence） ） 化学发光（ 化学发光（Chemiluminescence） ）
S0 λ2 λ1
内转移（ ） 相同多重态的两个电子能级之间 之间（ 内转移（ic） ：相同多重态的两个电子能级之间（如S2 S1,S1 S0）的非辐射跃迁 。 ）
S2 T1 S1
S0 λ2 λ1
5 荧光分析
3. 刚性平面结构
荧光物质的刚性和平面 性增加，有利于荧光发射。
芴 联苯
F=1
F=0.2
-O
O C
O
N N
荧光黄 不产生荧光
产生荧光
偶氮苯
COO-
F=0.92
-O C COOO
N N
偶氮菲
酚酞 产生荧光 不产生荧光
H3C CH3
萘 VA
CH2OH
F(萘)= 5F(VA)
4. 取代基效应
一、分子荧光与磷光的产生
luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence
1.单重态与三重态
电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数 和(0或1)； 单重态：全部轨道里的电子都是自旋配对的，S=0,M=1； 三重态：分子具有自旋不配对的电子，S=1,M=3. 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重 态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态；
1
K1 [M*]
M* Q k 2 M Q ΔH K2 [M*] [Q]
共振能量转移：
D* D hv , A hv A*
分子内能量转移：
N
D* ( S1 ) A( S 0 ) D( S 0 ) A* ( S1 ) D* (T1 ) A( S 0 ) D( S 0 ) A* ( S1 )
CH3 CH3
hv
+
_
N
CH3
CH3
（3） 氧的熄灭作用 氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，
1
3
M O 2 3 M* 3 O 2
分子荧光分析法
磷光是分子吸光成为激发态分子，在返回基态时 的发光现象.
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
的围比量
分 子 不 发 荧 光 。
不 如 吸 收 光 谱 法 广
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
1. 荧光强度与浓度的关系
F = φIa
其中 Ia = I0—I
I0——入射光辐射功率；
I——透射光辐射功率；
Ф——荧光效率（荧光量子产率）
荧光量子产率Φ
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：
发射荧光的分子数 发射的光子数 激发态的分子数 吸收的光子数
Φ与失活过程的速率常数k有关
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
☆内部转换(Inter-nal Conversion)
☆体系间跨越跃迁
去活化过程
1. 激发 2. 去活化过程
荧光强度及影响荧光的因素
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与荧光物质的吸光强度Ia及其荧光物质的荧光效率 φ成正比。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低 振动能级回到基态所发出的辐射。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基 态所发出的辐射。
1~3 ;
荧光分析法的特点
★★★
因应能试
为用提样
有范供用
的围比量
分 子 不 发 荧 光 。
不 如 吸 收 光 谱 法 广
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
1. 荧光强度与浓度的关系
F = φIa
其中 Ia = I0—I
I0——入射光辐射功率；
I——透射光辐射功率；
Ф——荧光效率（荧光量子产率）
荧光量子产率Φ
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：
发射荧光的分子数 发射的光子数 激发态的分子数 吸收的光子数
Φ与失活过程的速率常数k有关
☆振动驰豫 (Vibrational relaxation)
☆荧光发射(Fluorescence)
☆内部转换(Inter-nal Conversion)
☆体系间跨越跃迁
去活化过程
1. 激发 2. 去活化过程
荧光强度及影响荧光的因素
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度 （F）与荧光物质的吸光强度Ia及其荧光物质的荧光效率 φ成正比。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
分子荧光分析法简介课件
荧光光谱的测量
总结词
荧光光谱的测量是荧光分析中的重要环节，通过测量可以得到待测物的荧光发射光谱和 激发光谱。
详细描述
在测量荧光光谱时，需要使用光谱仪在特定的激发波长范围内扫描，记录待测物的荧光 发射光谱和激发光谱。同时，还需控制实验条件，如温度、溶剂等，以确保测量结果的
准确性和可靠性。
荧光量子产率的测定
荧光寿命的测定有助于了解荧光染料的发光 持续时间和能量衰减规律，有助于深入理解 荧光分析的原理和应用。
详细描述
荧光寿命的测定通常使用脉冲或时间相关偏 振光谱技术进行。通过测量染料在不同时间 点的荧光强度，可以计算出荧光寿命。该参 数对于优化实验条件、提高荧光分析的灵敏
度和特异性具有指导意义。
CHAPTER 05
CHAPTER 03
分子荧光分析法的分类
荧光分光光度法
总结词
一种常用的荧光分析方法，通过测量荧光光谱和荧光强度，对荧光物质进行定性和定量分析。
详细描述
荧光分光光度法基于荧光物质在不同波长光的激发下会发出不同波长的荧光原理，通过测量荧光光谱和荧光强度 ，可以确定荧光物质的成分和浓度。该方法具有高灵敏度、高选择性等优点，广泛应用于生物、医学、环境等领 域。
时间分辨荧光分析法
总结词
一种高灵敏度的荧光分析方法，通过测量荧光物质在不同时间点的荧光强度，对荧光物质进行定性和 定量分析。
详细描述
时间分辨荧光分析法利用荧光物质在不同时间点的荧光特性，通过测量不同时间点的荧光强度，可以 消除背景荧光的干扰，提高检测的灵敏度和准确性。该方法具有高灵敏度、高分辨率等优点，在生物 、医学、环境等领域有广泛应用。
分子荧光分析法的应用实例
在环境监测中的应用
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➢pH值 弱酸、弱碱
N 3 +H O H + - H
O - H N 2H H +
N -
pH<2
pH7~12 蓝色荧光
pH>13
4. 散射光： 一部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运
动方向发生改变而向不同方向散射。 瑞利散射光：选择适当的荧光测定波长或选用滤光片可消除
拉曼散射光：选择适当激发波长的方法消除
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大π键) （2）具有一定的荧光量子产率（）
发 吸
射 收
的 的
光 光
量 量子 子IIFa数 数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常 数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生；
定量分析：如果该物质的浓度不同，它所 发射的荧光强度就不同。
荧光分析法分类
1. 根据发光物质分类：分子荧光与原子荧光 2. 根据激发光的波长范围分类：
紫外-可见荧光、红外荧光、X射线荧光
荧光分析法特点： 灵敏度高、选择型好、样品用量少、操作简便
第一节 基本原理 一、分子荧光的产生
1.电子激发态的多重度
荧光光谱
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
拉曼光谱
瑞利光320nm
瑞利光350nm
拉曼光360nm
拉曼光400nm
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
5. 荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分 子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强 度与浓度不呈线性关系的现象。
选最强荧光强度的激发光波长λex为测定波长， 以提高灵敏度。
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激 发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与激发光波长关系曲 线(图中曲线II或III)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
发光分析法：物质吸收一定能量后跃迁到激发 态，激发态以辐射的形式释放能量返回低能态或基 态的现象所建立的分析方法。
光致发光： 以光能激发而产生的发光 光照、加热、化学反应、生物代谢等
荧光和磷光
荧光分析法：利用物质的荧光谱线位置及其强 度，对物质进行定性和定量分析的方法。
定性鉴别： 由于不同的物质其组成与结构不同， 所吸收光的波长和发射光的波长也不同。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃 回第一激发单重态的最低振动能级。
非辐射能量传递过程 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行
IF 2.3I0a b c
IF Kc 稀溶液
五、影响荧光强度的因素
1. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去激活的
几率减少，增加荧光效率，从而增加荧光强度。
2. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成
都将使化合物的荧光发生变化。
3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
2. 三维荧光光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定发射波长、扫描激发波长
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。
电子激发态的多重度： M=2S+1 S为电子自旋量子数 的代数和(0或1)；
大多数有机分子的基态处于单重态；
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光 系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、 羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分 子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。
(浓度限量1g~1mg/ml)
荧光熄灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄 灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻振动能级间的跃 迁。发生振动弛 豫的时间10 -12 s。
内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能 级交换。
辐射能量传递过程
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；
磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光波长(选最大激发光波长),化合物发 射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图 中曲线I ） 。
（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强 吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭
2.化合物的结构与荧光
（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系