第五章分子荧光分析法

➢pH值 弱酸、弱碱
N 3 +H O H + - H
O - H N 2H H +
N -
pH<2
pH7~12 蓝色荧光
pH>13
4. 散射光： 一部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运
动方向发生改变而向不同方向散射。 瑞利散射光：选择适当的荧光测定波长或选用滤光片可消除
拉曼散射光：选择适当激发波长的方法消除
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光的产生与分子结构的关系
2. 三维荧光光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定发射波长、扫描激发波长
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem)
固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱
VB1和VB2的三维荧光光谱
3. 荧光光谱的特征 a. Stokes位移:荧光光谱的波长比激发光谱的长 b. 发射光谱的形状与激发波长无关 c. 与激发光谱呈镜像关系 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
பைடு நூலகம்
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1
l 2 l 2
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高 振动能级至低相邻振动能级间的跃 迁。发生振动弛 豫的时间10 -12 s。
内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能 级交换。
IF 2.3I0a b c
IF Kc 稀溶液
五、影响荧光强度的因素
1. 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去激活的
几率减少，增加荧光效率，从而增加荧光强度。
2. 溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成
都将使化合物的荧光发生变化。
3. 溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
辐射能量传递过程
荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；
磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
l
‘ 2
>
l
2
>
l
1
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定荧光波长(选最大激发光波长),化合物发 射的荧光(磷光)强度与激发光波长的关系曲线 （图 中曲线I ） 。
发光分析法：物质吸收一定能量后跃迁到激发 态，激发态以辐射的形式释放能量返回低能态或基 态的现象所建立的分析方法。
光致发光： 以光能激发而产生的发光 光照、加热、化学反应、生物代谢等
荧光和磷光
荧光分析法：利用物质的荧光谱线位置及其强 度，对物质进行定性和定量分析的方法。
定性鉴别： 由于不同的物质其组成与结构不同， 所吸收光的波长和发射光的波长也不同。
电子激发态的多重度： M=2S+1 S为电子自旋量子数 的代数和(0或1)；
大多数有机分子的基态处于单重态；
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光 系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃 回第一激发单重态的最低振动能级。
非辐射能量传递过程 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的 非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行
选最强荧光强度的激发光波长λex为测定波长， 以提高灵敏度。
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选最大激 发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与激发光波长关系曲 线(图中曲线II或III)。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质。 如卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、 羰基、羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。
荧光自熄灭：荧光物质浓度超过1g/L时，增加荧光分 子间碰撞几率而产生的荧光熄灭现象。
(浓度限量1g~1mg/ml)
荧光熄灭法：利用荧光物质荧光强度的减弱与荧光熄 灭剂的浓度呈线性关系测定荧光熄灭剂含量的方法。
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有强的紫外-可见吸收的特征结构(共轭大π键) （2）具有一定的荧光量子产率（）
发 吸
射 收
的 的
光 光
量 量子 子IIFa数 数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常 数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生；
荧光光谱
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
拉曼光谱
瑞利光320nm
瑞利光350nm
拉曼光360nm
拉曼光400nm
硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与拉曼光谱(b)
5. 荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与溶剂分 子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度降低或荧光强 度与浓度不呈线性关系的现象。
定量分析：如果该物质的浓度不同，它所 发射的荧光强度就不同。
荧光分析法分类
1. 根据发光物质分类：分子荧光与原子荧光 2. 根据激发光的波长范围分类：
紫外-可见荧光、红外荧光、X射线荧光
荧光分析法特点： 灵敏度高、选择型好、样品用量少、操作简便
第一节 基本原理 一、分子荧光的产生
1.电子激发态的多重度
（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移
（3）取代基效应：芳环上有供电子基，使荧光增强 吸电子基，使荧光减弱甚至熄灭
2.化合物的结构与荧光
（4）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。
四、荧光强度与荧光物质浓度的关系