细菌的各种计数法

1、计数器测定法：

即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。

本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。

2、电子计数器计数法:

电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。

3、活细胞计数法

常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。

广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。

4、比浊法

比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。

此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。

5、测定细胞重量法

此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。

此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。

6、测定细胞总氮量或总碳量

氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。

7、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU）

这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作：

（1）.取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。

（2）.在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管

（3）.于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml.

一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。

测定微生物生长的方法很多，各种方法均有其优缺点，也不是在任何情况下都适用。在微生物学工作中一般常用的是平皿菌落计数法、计数器法和比浊法。至于哪种方法比较适合你，得根据你的具体条件而定。

采用滤膜法进行微生物检测是一种国际公认的微生物标准检验方法，其得到AOAC、美国、欧洲和日本等国家的药典、FDA和EPA等组织的承认，广泛应用于环境监测、食品及饮料工业、化妆品、制药工业品质控制和电子工业等领域。

而在我国每一新版药典中无菌检查法（微生物限度检查）在都有不同程度的改进和提高，特别是2000年版药典较95版药典有了较大提高，大幅度增加了样品的取样量，提高了阳性检出率。2005年版药典更加完善，既增加了样品的取样量，又延长了培养时间，降低了漏检率，提高了安全性，和各国药典接近，与国际接轨，提高了我国的药典标准。

2005版《中国药典》规定只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。赛多利斯公司的滤膜法微生物检测产品成功地应用于滤膜法已有20多年的历史，实用而且方便实用，它简化了微生物检测程序。

滤膜法微生物检测：

将适当孔径的滤膜放入滤器，过滤样品，由于滤膜的作用而将微生物保留在膜的表面上。样品中微生物生长抑制剂可在过滤后用无菌水冲洗滤器而除去。然后，将滤膜放在培养基上培养，营养物和代谢物通过滤膜的微孔进行交换，在滤膜表面上培养出的菌落可以计数，并和样品量相关。

滤膜法的优点：

- 与直接法比较，可以检测大量的样品

- 浓缩效应使微生物检测的准确度提高

- 带有菌落的滤膜，可作为检测的永久记录存档

- 可见的菌落和样品量直接对应，得出定量结果

细菌计数counting of bacteria

指测计酵母、细菌等的细胞数。有总菌计数和活菌计数两种计数法。后者是测计试样中的活细菌数。二者都是先把试样稀释成适于测计的浓度，再用种种方法进行细胞数的测计。一般认为用细胞计数器测计更为精确。有的方法是把细胞用血球容量计进行离心沉淀，从其刻度的容积进行换算；还有一种方法是比浊法。在测计固氮细菌时，可用凯氏定氮法测定有机氮（或是蛋白态氮），然后换算成细菌数。进行活菌计数时，先把样品稀释，然后将一定量稀释样品混入依菌性质制成的溶融状态的琼脂培养基中进行平面培养，再根据菌落数进行统计。对已鉴别过的菌种或具有某种特定性质的细菌来说，活菌计数比较简单，但对土壤微生物区系量的分析就比较复杂了。在微生物学研究中,经常需要测定培养溶液中细菌数量,比色法和比浊法是常用的方法,细菌培养液中含有活的和死的细菌、未利用完的培养基以及细菌生长过程中的代谢产物等,因此,培养液的吸光度值并不完全是细菌(活细菌、死细菌)数量的真实体现。作者比较了2 种方法(细菌培养原液、培养液离心后沉淀+ 无菌水) 测定培养液中细菌数的差异和对细菌生长曲线测定结果的影响,以期为液体培养条件下细菌数的快速测定提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验用菌株

由患烂爪病的中华鳖血液中分离所得,并经检验为气单胞菌属嗜水产气单胞菌种。