硝酸还原酶活力测定

腐烂分解的产物。但这些含氮化合物大
多是不溶性的,通常不能直接为植物所
利用，植物只能吸收其中的氨基酸、酰
胺、尿素、水溶性的有机氮化物。。
2、无机氮化物(以铵盐和硝酸盐为主)
铵态氮(NH+
4)
植物可直接吸收、 利用并合成氨基酸
ห้องสมุดไป่ตู้
硝态氮(NO-
3)
必须经过还原形成铵 态氮后才能被利用。
硝酸盐的还原
在一般的土壤条件下，NO-3是植物吸收的主
诱导酶：又称适应酶，指植物体内本来不含有，
但在特定外来物质的诱导下可以生成的酶。如硝
酸还原酶可为NO3-所诱导。
例如，水稻幼苗本无硝酸还原酶，但如果培养
在硝酸盐溶液中，水稻体内就会诱导生成硝酸还
原酶，这是高等植物中底物诱导的实例。
硝酸还原酶活性测定方法：
离体法：需将材料磨成匀浆，经过低温离心除去残渣，吸取 上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨 中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。
NR活性(μg NO-2 /g鲜叶/h)
查标准曲线得NO-2浓度（μg） × 24％ ＝
0.5g × 0.5 小时× 1ml
10ml
55％
21％
九、注意事项
1.取样前叶子需进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，否则 酶活性低。 2.叶片要用打孔器取样(或用剪刀剪成大小一致的小块)。 3. 无机磷对NR活力有促进作用，因此常用磷酸缓冲液。 4. 活体法酶促反应在暗条件下进行，以防止亚硝酸盐还原为氨。 5.亚硝酸的磺胺比色法比较灵敏，显色速度受温度和酸度等因素的影
活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO-2 进入细胞后，被
硝酸还原酶还原成NO-2 并扩散到细胞外在溶液中积累，测
定溶液中NO-2 的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。活
体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不 断生成，无需外加。
实验六 硝酸还原酶活性的测定
(活体法)
一、意义及目的要求 二、原理 三、仪器设备 四、试剂配制 五、实验材料
1、取样及反应：将甘薯叶片洗干净吸干，用打孔器取大小 一致的小圆片，混合均匀，迅速称取0.5克样品3份，分 别置于3个50毫升三角瓶中。
瓶 号
1(对照) 2(测定瓶) 0 9 10min 30min 1 3(测定瓶) 0 9 10min 30min 1
试剂（ml）
30%三氯乙酸 0.1mol/L KNO3 放入真空干燥箱抽气时间 放入恒温培养箱30℃暗处 30%三氯乙酸 1 9 10min 30min 0
响。 因此标准液与样品的测定应在相同条件下进行，方可比较。
6.叶片要抽气，使叶圆片中的空气抽去而沉于溶液中。
思考题：
1．测定硝酸还原酶的材料为什么要提前一天施用
一定量的硝态氮肥，并且取样应在晴天进行？
2．测定硝酸还原酶活性的活体法和离体法各有何 特点？ 3．酶促反应为什么要在暗处进行？
五、试剂配制
1、0.2mol/L 硝酸钾 2、0.1mol/L 的磷酸缓冲液，pH=7.5 A 液：0.2mol/L NaH2PO4 B 液：0.2mol/L Na2HPO4 3、1%磺胺 4、0.02%萘基乙烯胺 5、亚硝酸钠标准液 6、30%三氯乙酸
六、实验材料: 甘薯叶片
七
操作步骤及注意事项：
六、操作步骤 七、结果计算 八、思考题 九、注意事项
植物生理生化实验
二.目的要求
1、了解NR测定对植物氮代谢的重要意义 及实际应用。 2、了解离体法和活体法测定NR的不同点。
3、掌握活体法测定NR的原理及其技术要点。
4、掌握测定过程相关仪器的使用方法。
55％ 21％ 24％
三、原理：
硝酸还原酶可以将NO3-还原成NO2-，其反应为： NO3-+NADH+H+
要形式。NO-3进入细胞后被硝酸还原酶(NR)和亚 硝酸还原酶(NiR)还原成铵。其中NR是这一反应 的限速酶。
NR
NiR
硝酸还原酶催化硝酸盐还原为亚硝酸：
NR
NO-3+ NAD(P)H+H+
NO-2+ NAD(P)++ H2O
亚硝酸还原酶催化亚硝酸盐还原为铵：
硝酸还原酶是一种诱导酶，诱导物是 NO3- ，光照可促进硝酸盐的还原过程。
NR
NO2- +NAD++H2O
在一定条件下，NO2- 的生成量与硝酸还原 酶活性呈正相关。 NO2- 含量可用磺胺显色法 测定，即在酸性条件下与对-氨基苯磺酰胺发 生重氮反应，生成的重氮化合物又与N-萘基乙 二胺盐酸盐（或α-萘胺）生成红色偶氮化合 物，可在540nm下比色测定。反应如下：
四、仪器设备
实验六 硝酸还原酶活性的测定
为什么要测定硝酸还原酶活性？？!
植物生理生化实验
一、测定意义
硝酸还原酶（NR）是硝酸盐同化中第一个
酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置
。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量
和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当 作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为 品种选育的指标之一。
2、NO-2的测定：
试管编号
反应液(ml) 1%磺胺试剂(ml) 0.02%萘基乙烯胺(ml) 显色时间 540nm OD值 每管含NO-2 的μg数 对照 样1 样2
1 2 2
1 2 2 15min
1 2 2
o 0 24％
? ?
? ?
55％
21％
八.结果计算：
根据测定的OD值，从标准曲线查出NO-2浓度（OD值/0.307=μg） 代入以下公式：
55％ 21％ 24％
植物的氮源
空气中含有近80%的氮气(N2),但植物却 无法直接利用这些分子态氮。只有某些微生
物(包括与高等植物共生的固氮微生物)才能
直接同化利用分子态氮，而植物所利用的氮 源,主要来自土壤.。
植物主要利用土壤中的含氮化合物：
1、土壤中的有机含氮化合物主要
来源于动物、植物和微生物躯体的