薄层色谱板的制备和使用
实验一薄层色谱板的制备和使用
目的要求：
通过实验进一步理解薄层色谱技术理论，熟悉掌握薄层色谱板的制备和使用方法。
一、薄层层析的基本原理
把吸附剂（固定相）均匀地铺在一块玻璃板上，将待分离的样品溶液点加在一薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相）展开，由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同及溶剂对不同物质溶解分配系数不同，当溶剂流过时，各物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附，解吸附，再吸附，再解吸附。不易被吸附或易被溶剂溶解的物质相对移动得快一些。经过一段时间的展开，不同的物质被彼此分开，最后形成相互分离的斑点。将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，应用特定的试药或方法将斑点显色，从而达到定性和定量的目的。
二、薄层板的制备
1．玻璃板
用一块玻璃板涂上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等，玻璃板要求薄厚一致，大小相同，表面光滑平整，一般玻璃只要合乎这些要求就可。如果找不到平整均一的，将旧光学照像底片截成同样大小也可以。用前先将玻璃用肥皂和水洗干净，必要时浸泡在清洗液中，然后水洗烤干，用纱布擦光。
玻璃板大小有各种规格，一般有20×20、20×10、20×5厘米，也有更小的，可根据需要自行设计。宽度要求至少能点开两三个样品，每两点之间相隔至少1.5厘米，玻板长度一般要满足展开10厘米的距离。点样的起点应距底边至少1.5厘米的距离。
2．吸附剂
应用最广泛的为硅胶和氧化铝，市场上有专供薄层色谱用的吸附剂，规格分不含粘合剂的硅胶H，氧化铝H和含有粘合剂熟石膏的硅胶G，氧化铝G，如市售硅胶G含13％熟石膏，氧化铝分中性、酸性、碱性三种。吸附剂的粒度范围最好在180－200目之间，太小了流速慢，太大则影响分离效果。如不合要求，应过筛。
3．薄层板的涂布
最简单的涂布方法是用两条比玻璃板厚0．25毫米的玻璃条或有机玻璃条（或在同样厚度的玻璃条下粘一层胶布），将玻璃板夹住，把调好的吸附剂浆液平铺在薄层板上，然后用一有机玻璃条或直尺，迅速均匀地向前推进，就象推血片一样，只要推进的速度均匀一致，
即可得到薄厚均匀的薄层板，如在一块玻璃板末端再接一块相同的玻璃板，把剩余的装液接过去，可使涂层边缘整齐，厚度一致，吸附剂浆液的加水量和搅拌时间是涂布成败的关键，像12×8平方厘米的玻璃板需要2~3克硅胶G，加4~6毫升水即可，只要技术熟练即能涂成厚薄一致，光滑平整的一块薄层板。不同性质不同批号的吸附剂，加水量和搅拌时间有时可有差异，应根据情况摸出规律。为了达到涂布的各板厚度均匀一致，最好采用涂布器进行薄层的涂布。
为了增加薄层的牢固性及易于保存，可在涂布过程中加入某些粘合剂以增加薄层的硬度。
一般采用添加剂羧甲基纤维素钠（CMC—Na），应用方法是取CMC-Na 1克溶于100毫升水中，加热煮沸溶解，按比例与硅胶搅匀，铺板。涂成之后先把玻板放在平面上，室内干固，再对光检查，看是不是均匀，有无气泡，平整光洁度如何，合格的上烤箱110℃加热30分钟进行活化，冷却后贮于干燥器内备用。
在进行实验时，应尽量可能采用同批号涂布活化的薄层板，以减少因活化不一致引起的Rf值发生差异，目前国内市场已有成品供应，如黄岩化学分析材料厂即有各种类型的薄层板出售。
三、薄层板的使用
1．点样
将样品溶于适当的溶剂中（应尽量避免有水），取微量注射器或玻璃毛细管截齐后，吸取一定量的检样，轻轻接触到薄层上，使样品自动吸到薄层上，点的直径不要超过0.3厘米，一次不能点完，待干后再点，稍有过分就会损伤板面，影响展开后的斑点形状。每两个样点之间相距至少1.5厘米。点样的起点距薄板底边至少1.5厘米，以免样点浸入展开溶剂中，同块薄板上各样点应保持在与底边平行的一条直线上，为控制好点样距离，应用薄层点样尺架。
2．展开
根据薄层板大小，自行选用适当玻璃标本缸，长方形，如17×10×6厘米的标本缸可容纳下15×9厘米的玻璃板。采用较大的玻璃缸和玻璃板时，在缸内沿周围缸壁衬一层预先浸有溶剂的滤纸，以便缸内展开溶剂易达到饱和，防止边缘效应（即两边缘的点走得快）和同一物质Rf值不一致现象。
一般将薄层板斜置展开容器内，密闭。先不使溶剂浸湿薄层板，饱和10~15分钟后再进行展开，展开溶剂沿着薄层板向上移动。对加粘合剂的涂板可以近于垂直的状态进行展开，
而对未加粘合剂的薄层板则必须以倾斜状态（15度角）进行展开。为了防止产生“边缘效应”和展开溶剂不饱和现象。还可采用夹心式展开容器，其方法是将薄层板的左右两侧各刮去5~10毫米，垫上条状玻璃或塑料，盖一块与薄层板同样大小的玻璃，用夹子将两边夹好，插入展开溶剂中进行展开，并能取得良好效果。
3．显色
薄层展开后，凉干。如含粘合剂，即可直接喷显色剂，使之显色，有的还需经紫外线（254nm）照射后方能显色；对不含粘合剂的薄板，在喷显色剂时应尽量远离薄层板，否则会连吸附剂一起吹掉，应予以注意。
四、检样的定性定量分析
1．比移值（Rf）的测定
当样品的薄板一端被展开，经过毛细管作用流向另一端，样品是按一定的比例分配在固定相与流动相之间。并沿着溶剂流动的方向移动，由于样品中各组分在两相中分配系数不同，各组分的移动速度也不同，经一定距离后使各组分彼此分离。样品各组分移动的速率，亦即分离后在薄层板上的位置与溶剂展开前沿的距离的比值为比移植。
2．定性分析
相同的物质Rf值应当是相同的，但因能影响Rf值的因素很多，要想得到与标准物质相同的Rf值，最好在鉴定时，将样品与标准物质点在同一张薄层板上一同展开，根据检样斑点的Rf值与标准样品的Rf值比较，即可确定二者是否相同，但要做到准确的定性，需要两种以上展开溶剂系统所得的Rf值比较判断。
3．定量分析
（1）目测比较法
①用吸附剂（如硅胶G）涂布成厚0.25~0.5毫米，大小20×20厘米的薄层板，110℃活化30分钟，室温冷却。
②用微量注射器（10微升）在距板底1.5厘米处，将标准样品溶液按1、3、5、7微克自左向右点在起始线上，然后再吸取不同量的检材提取溶液（相同于1、3、5克检材的提取溶液）按次序点在同一板的右侧。
③选择比移值适中的展开剂（Rf在0.45~0.75之间者）用夹心式展开法或连续薄层展开法。展开距离为10厘米，显色剂要求能使显色后的斑点明显清晰。这样得到的色斑比较集中，重现性好，便于比较。
④显色后，观察其色斑大小，深浅与已知不同浓度的标准样品系列色斑相比较，粗略
定出含量，然后算出检液总体中含量，根据所取检材量，求出百分含量。
（2）洗脱测定法
①在制备好的薄层板左端，先点一标准样品点，作为对照定位用，然后根据检材提取溶液的多少，在同一板的右端点成点状或线状。
②置玻璃缸中展开（如有连续薄层展开仪更好），展开后晾干，再用玻璃板遮住右侧检材部分，仅使对照定位点显色。
③显色后，根据斑点位置将未显色部分（相当于色斑所在部分）的吸附剂用刮刀刮下或用抽吸法收集起来。
④将收集的吸附剂置于小层析柱管中，用极性大的溶剂甲醇或乙醇进行洗脱，收集洗脱液并加以浓缩。
⑤用适当溶剂调整到一定体积，可用紫外分光光度计，在被检物最大吸收波长处进行测定。同时用薄层吸附剂洗脱液作空白吸收值测定。
如有灵敏度高专属性好的比色反应，还可用比色计测定化合物的含量。
上述洗脱液亦可作为气相色谱仪、液相色谱仪分析前的处理液。
（3）薄层色谱扫描仪测量法
以洗脱法处理层析色斑，不仅操作麻烦，而且有些待测成分不能定量地洗脱下来。或者在洗脱过程中发生分解，影响测定结果的准确性，最好是采用双波长薄层色谱扫描仪直接定量检测，经电子积分器积分推算出检样中待测物质的含量。其测定方法包括为：①斑点面积测量法；②斑点光密度测量法；③斑点荧光测量法。
附：实验仪器
1．薄层涂布器2．微量注射器3．薄层点样尺架
4．薄层板展开缸5．吸引器6．喷瓶
7．烘烤箱
实验二氢氰酸及氰化物的检测
目的要求：了解氰化物中毒的条件和毒性反应，掌握氰化物的化学性质，检材的采取及处理方法和常见的鉴定方法。
一、检材采取和毒物的分离
1．检材采取：最好的检材为中毒者剩余的食物、饮料、呕吐物及尸体胃和胃内容物，其次为血液，肺、肝、脑等。吸入中毒的应采取血液为宜。检材应盛于密闭容器内，并尽量少留空间，尽快进行检验，不能及时检验者应将检材低温冰冻保存。
2．毒物分离：含氰化物中毒检材的分离采用水蒸气蒸馏法
（1）分离原理：氰化物遇酸可形成易挥发的氢氰酸，氢氰酸具有较高的蒸气压，检材在酸性条件下当和水同时加热或通入热水蒸气时，能随水蒸汽在较低的温度沸腾蒸馏出来，在碱性环境下被冷却收集，达到分离的目的。
（2）操作方法：取适当量检材（10～50克），剪碎或捣碎，放入250毫升圆底烧瓶中，加水2倍，再加10％的酒石酸酸化（PH5）。取1000毫升烧瓶作为水蒸气发生瓶，倒入热水，投入数小块沸石，上插安全管（长度60厘米的玻璃管）。按图所示：
用连接管将两瓶相连，将检材瓶浸入水浴锅中接上冷凝管，收集液瓶中加入5毫升0.01N 氢氧化钠溶液使接收管直接通到受液瓶中稀碱液液面下，以防馏出氰化物逸失，检查所有瓶塞及各接头处紧密不漏气后，将水蒸气发生瓶和水浴锅同时加热，收集馏液10分钟备检。
〔注意事项〕
（1）检材处理的愈碎愈好，检材溶液必须呈酸性。
（2）蒸馏装置的各接头处必须严密不漏气。
（3）蒸馏完毕后，应先将受液瓶取下，再将水蒸气发生瓶的瓶塞放松，或将水蒸气发生瓶与检材瓶之间的连接处拆开，然后再停止加热以防各瓶之间相互倒流。
（4）对血液、面糊、稀粥等检材，可加入2～3毫升液体石蜡或适量的三氯醋酸溶液，以避免蒸馏时发生大量的泡沫溢入冷凝管。
（5）蒸馏瓶中的内容物，不能超过瓶容积的1/3。
二、氢氰酸及氰化物的鉴定方法
（一）普鲁士蓝反应：
1．原理：蒸馏出来的氢氰酸吸收在稀碱溶液中生成氰化钾，加硫酸亚铁后生成亚铁氰化钾（黄血盐），后者与溶液内亚铁氧化成高铁，在酸性条件下，化合为亚铁氰化铁，即普鲁士兰或柏林蓝。该反应是氰化物的专属反应，阳性结果可确证氰化物的存在，反应灵敏度为1：5000。
2．操作方法：取蒸馏液3～5毫升，加新配的20％硫酸亚铁2滴，加热至恰沸，加稀硫酸使成酸性，如有氰根视含量多少，溶液有蓝绿色至深蓝色。量多即析出蓝色沉淀，量少时颜色和沉淀可能要隔24－48小时后才显出。
（二）氰化物的快速检验法
检材不经水蒸气蒸馏，可直接做普鲁士兰试验。
1．原理：氢氰酸与硫酸亚铁－氢氧化钠试纸作用生成亚铁氰化物，在酸性条件下，再与由空气氧化产生的三价铁离子作用生成普鲁士兰。
6HCN+Fe2++6OH-= Fe（CN）64-+6H2O
4Fe3++3 Fe（CN）4-6＝Fe4[Fe（CN）6]3（普鲁士兰）
2．操作方法：取检材5～10克，置锥形瓶中，加适量水调成稀糊状，加10％的硫酸使之变成酸性，取滤纸一小方，滴加新配制的20％硫酸亚铁2滴及10％氢氧化钠2滴，将此滤纸覆盖于锥形瓶口，瓶底缓缓加热，待有蒸气上冒，取下滤纸，浸入6N盐酸内，如有氰根，滤纸即蓝色斑点，水洗，色斑更鲜艳。
实验三血中一氧化碳的检测
目的要求：熟悉一氧化碳中毒的特征和检材的采取要点，掌握碳氧血红蛋白分析鉴定方法及饱和碳氧血红蛋白的制备技术。
一、检材的采取
一氧化碳中毒检材以取血液为最好，对于尸体通常是采取心腔内血液进行检测。活体通常静脉采血并要加抗凝剂，密封。盛装检血的容器应将检血装满不要留有空间，以避免一氧化碳损失而影响检验结果。
二、碳氧血红蛋白的鉴别试验
1．煮沸法
取血2－3毫升，置试管内，放水浴锅中加热，使发生凝固。如系一氧化碳血，呈砖红色凝固体，而正常血则呈褐色或黑褐色凝块。
此法最简便，不需任何试剂，在勘验现场即可进行，但含量在40％才可测出。
2．硫化铵法
取水10毫升，加血5滴，加硫化铵5滴，较混合之，再加少量10％醋酸使微呈酸性，如系一氧化碳血，呈玫瑰色；而正常血为绿褐色。
此法灵敏，含量在10％即可检出。
3．碱液稀释法
取血1－2滴，加水稀释至1 5毫升，再加5滴10％氢氧化钠，同时取一正常血样作对照，与碱液混合后立即记下时间，正常血由于碱性正铁血红素的形成，立即变为草绿色或绿褐色而含10％以上一氧化碳血液需要15秒钟后才变为草绿色或绿褐色；含50％者需要50秒钟后。
4．钯镜试验
（1）原理：碳氧血红蛋白与硫酸作用释放出一氧化碳，一氧化碳可使氯化钯还原成钯镜。
(2)操作方法：取扩散皿(孔威氏盒)一个，内槽内放入0.5毫升0.1％氯化钯溶液，外槽内一侧放入0.5毫升检血，另一侧放入0.5毫升10％硫酸溶液（封盖前不要让它们接触)，然后盖上盒盖，轻轻摇晃使血液与硫酸充分接触。20分钟至2小时内观察试验结果，如有一氧化碳释出，可见内圈形成发亮的钯镜。
以上各鉴别试验，一定要取正常血同时做对照试验，以作对比。
三、碳氧血红蛋白的定量检验
1．实验室中饱和碳氧血红蛋白的制备：
实验装置图见下：
1.硫酸
2.甲酸
3.血液
4.20％NaOH
一氧化碳发生装置
先将浓硫酸加热，而后扭开分液漏斗活塞，让甲酸（H－COOH）一滴一滴与浓硫酸接触，即有一氧化碳气体冒出，经过洗气瓶，通入盛有正常血的瓶中，10毫升血（用0.05克枸椽酸钠作抗凝剂）通一氧化碳约15分钟，即可使血红蛋白的一氧化碳饱和度达l00％，避免通气过猛，以免血液内产生大量泡沫外溢。因每人Hb含量不同，最好取死者血通以一氧化碳使达饱和，可省去换算。
2．吸收光谱法测定血中HbCO饱和度
在各类测定方法中，研究和应用最多的是利用可见光吸收光谱的分光光度法来测定血中HbCO饱和度。
（1）原理：双波长吸光度比值法：CO中毒的检血中同时含有HbO2、HbCO、MetHb 和Hb的血，用连二亚硫酸钠使之还原后，血样中只含有HbCO和Hb两个组分，其吸收光谱是HbCO和Hb两者吸收光谱的加和。因555nm是Hb的最大吸收波长，538nm是HbCO 的最大吸收波长之一，所以，随着血中HbCO饱和度的增高，555nm处的吸光度减小，而538nm处的吸光度增大，538nm处的吸光度与555nm处的吸光度之比值A538／A555也随着HbCO饱和度增高而增大，且其间也有近似直线的关系。故可用下式计算血中HbCO饱和度。用下式表示。
HbCO(％)
×100％
上式中括号外的下角标，X表示未知HbCO饱和度的血样，0与100分别表示HbCO饱和度为0％和100％的血样。
（2）操作方法：先将非吸烟者的血样用0.1％碳酸钠溶液稀释约200倍，加入少许连二亚硫酸钠（约0.1％）后，放置15min。使HbO2还原，在538nm和555nm处测定吸光度，计算得HbCO饱和度为0％的比值。再将此溶液通入一氧化碳气体使Hb全部转变为HbCO，在相同两波长处测定吸光度，并计算出HbCO饱和度为100％的比值。检血也按上述方法稀释并加入还原剂，同样波长处测定吸光度，得出比值。将所得三个比值代入上式即可求出未知血样的HbCO饱和度。
此方法对HbCO饱和度较高的检血有较好的重现性，但不适合测定HbCO饱和度低的检血。方法对检血的稀释不要求很精确；HbCO饱和度为0％和100％的比值一次测定后，只要条件不改变，不必每次都测。通常(A538／A555)0的值为0.775，(A538／A555)100的值为1.233。
实验四酒精的检测
目的要求：熟悉对含酒精检材的采取保存方法，掌握酒精的常用鉴别试验。了解气相色谱理论和设备；初步熟悉应用气相色谱进行定性、定量分析的方法。
一、检材的采取保存和分离
1．乙醇中毒可取血、尿、唾液、胃内容物及呼出气为检材，其中血液为首选检材，此外还可采脑、肺、肝、肾等脏器为检材。采取血液以周围静脉血（股静脉）为宜。
2．含酒精的检材应及时检测，如不能及时检测，应放置冰箱内保存。盛装检材的容器在保存检材时应装满不要留有空间，并进行密封以避免酒精挥发损失。
3．对所有生物检材中含有的酒精可采用蒸馏法进行分离，对血、尿等液体性质检材亦可直接取样进行微量扩散和气相色谱分析，胃内容物可将其离心后取上清液直接做分析测定。
二、酒精的颜色反应
1．碘仿反应
（1）原理：碘与碱作用生成次碘酸盐，能将乙醇氧化成乙醛，乙醛与碘作用生成三碘乙醛，再与碱作用，生成黄色碘仿。
（2）操作方法：取溜液2—5毫升，放入试管内，加10％氢氧化钠溶液数滴混合。滴加碘化碘钾试剂至溶液呈浅黄色。在60℃水浴上加热，如颜色消退，再加碘液至黄色，多余的碘液可加几滴氢氧化钠除去，静置后如馏液中含有乙醇，即有黄色结晶沉淀析出，置显微镜下观察结晶呈六角形。
【注】本反应并非乙醇所特有，乙醛、丙酮、甲基酮及能被次碘酸盐氧化为乙醛，或甲基酮的醇均能产生同样反应。
2．微量扩散法――预试验
（1）原理：重铬酸钾与乙醇或其他还原性物质（醛类和其它低级分子）作用时，被还原成Cr3＋，颜色由橙黄色转为兰绿色。
（2）操作方法：在扩散皿的内槽中放置重铬酸钾－硫酸试剂1毫升，外槽一侧加饱和碳酸钠1毫升，另一侧加入检血1毫升，盖上盒盖后，倾斜旋转使检血和碳酸钠溶液接触混合，放置一小时，观察结果，如检材内含有乙醇，以其含量大小呈现黄绿至蓝色变化，见下表1血中乙醇不同含量的颜色变化；表2血液中乙醇浓度与酩酊度。
表1 血中乙醇不同含量的颜色变化
表2 血液中乙醇浓度与酩酊度
血中乙醇
含量％
0－0.05 0.05－
0.15 0.15－
0.30
0.25－
0.40
0.35－
0.50
0.50
酩酊度初出现异
常状态
行动尚较
正常，但已
欣快多话
正常行动
较难，思考
力减退
行动已困
难但意识
仍较清楚
昏睡致死
三、气相色谱分析
【色谱条件】
色谱柱：4mm×2m不锈钢柱，内装10％PEG20M，Chromosorb W(60～80目) 4mm×2m不锈钢柱，内装GDX－201 W(60～80目)
FID检测器和气化室温度：150℃；柱温：lOO℃。载气(N
2)流速：45ml／min；H
2
：35ml
／min；空气：300ml／min。
【操作】
在10ml左右的玻璃瓶(顶空瓶)中加入0.5ml检材(血或尿)，0.5ml内标液，约1g硫酸铵，加盖聚四氟乙烯薄膜和胶塞，用铝盖封好，摇匀，置于60℃水浴中加热15～20分钟，用事先预热好的注射器抽取200μl气体，迅速注入气相色谱仪，记录乙醇和正丙醇的峰面积。
再取0．5m1正常血(或尿)加入顶空瓶中，加入0．5ml标准液(含乙醇和正丙醇各为0．5mg ／m1)和约1g的硫酸铵，加盖聚四氟乙烯薄膜和胶塞，加铝盖密封，其余操作和检材相同，求出乙醇和正丙醇的峰面积比(K)，重复操作三次取平均值，检材中乙醇的含量按下式计算：
检材中乙醇的含量(mg／m1)＝A
乙醇/A
正丙醇
×1/K×C
乙醇
其中
A
：检材中乙醇所产生的色谱峰面积。
乙醇
：检材中正丙醇内标产生的色谱面积。
A
正丙醇
附：试剂
1．碘化碘钾试剂：2克碘化钾与1克碘溶于50毫升水中。
2．重铬酸钾一硫酸试剂：重铬酸钾0.37克，溶于15毫升水中，然后缓慢加入2毫升浓硫酸，边滴加，边搅动，放冷后备用。
实验五合成药物的检测
巴比妥类药物的检测
目的要求：熟悉巴比妥类药物的理化性质，掌握由检材中提取的分离原理和常规的分析方法，通过实验熟悉薄层色谱在毒物分析工作中的使用技术。
一、检材的采取
巴比妥类药物中毒以胃内容物、肠内容物、胃液以及血、尿或肝、脑等脏器为检材。
二、检材的分离提取
1．原理：巴比妥类安眠药属于弱酸性有机化合物，在酸性条件下形成巴比妥类衍生物能溶于大部分有机溶剂。在碱性条件下形成巴比妥盐类物质溶于水而不溶于有机溶剂。根据这一化学性质，在对检材的分离提取过程中，应首先酸化检材使形成盐的巴比妥类药物转化成巴比妥酸类衍生物，再用有机溶剂进行提取。
2．分离提取
取尿液50毫升，加10％硫酸酸化至PH5－6后，置分液漏斗内，用氯仿溶剂50毫升，30毫升，20毫升分别提取三次，合并提液，用10克无水硫酸钠脱水，加少量活性炭脱色(如溶液清亮也可不脱色)，提取液置蒸发皿中，在水浴上将溶剂挥干，剩残渣供检测使用。
3．尸体内脏的快速提取法：
取尸体脏器及干性胃内容物50--100克，捣碎后加入10％硫酸酸化，加入无水硫酸钠将检材研磨至粉渣状，置三角烧瓶中用氯仿或乙醚分三次浸提，合并提取液，再加无水硫酸钠脱水，加活性炭脱色，将提取液置蒸发皿中，在水浴上将溶剂挥干，剩残渣供检测使用。
三、颜色反应
1．硝酸钴－氨液反应：
原理：巴比妥类安眠药的分子结构中有环脲酰－C＝NH基团，在碱性条件下，可与钴盐发生显色反应，生产紫红色络合物。
操作方法：将检材提得的残渣加入少量乙醚溶解后滴加在滤纸上，再加1％硝酸钴无水酒精液数滴，置于浓氨水瓶口熏以氨气，如呈现紫红色表示有巴比妥酸的存在。若滤纸于1－2分钟内呈黄色，边缘有时呈青绿色，则为阴性。本反应必须在无水条件下进行，所用一切容器要干燥，应同时作阴性及阳性对照。
2．硫酸铜一吡啶反应
O O
(1)原理：巴比妥分子中含有一C—NH—C—NH基团，可与铜盐作用，发生类似缩二脲的反应，生成有色络合物，含氧巴比妥呈红色，含硫巴比妥呈绿色。
(2)操作方法：将检材提取残渣加入少量吡啶氯仿液溶解，再加硫酸铜吡啶液2滴，如含巴比妥类安眠药即显红紫色，硫喷妥呈显绿色。
注意：此反应也可于滤纸上进行，显色剂硫酸铜吡啶勿用过量，否则试剂本身颜色会掩盖反应结果。
灵敏度100一200微克。，
四、薄层色谱法
1．薄层板
硅胶G板或硅胶CMC板
2．展开
(1)苯：丙酮(8：2)展开剂
(2)苯：二氧六环：二乙胺(7：2：1)展开剂
(3)氯仿：丙酮(9：1)展开剂
3．显色
(1)硫酸汞－二苯卡巴腙试剂
(2)硝酸银－二苯卡巴腙显色剂
操作方法：当层析后取出薄层板晾干，喷硫酸汞液或硝酸银丙酮液，此时巴比妥类药物显白色斑点。再喷以0.2％二苯卡巴腙氯仿液薄层背景即呈蓝紫色并慢慢褪去，杂质是不规则的蓝色斑点，而巴比妥类药物则呈现紫色斑点。
4．测量计算判断结果
五、紫外分光光度法的定量检测
(一)原理：一定浓度范围内(每毫升含药物2—30微克)的巴比妥类药物在PHl4和PHl0溶液中于紫外波长260nm处相互吸收差值成正比。根据检液在260nm处的吸收差值，同已知药物的标准曲线对照，得知检液浓度，从而计算出药物含量。
(二)操作方法
1．标准曲线
(1)标准溶液的配制及紫外吸收测定
取每毫升含1毫克速可眠等巴比妥类药物的甲醇液1.5毫升于50毫升烧杯中，置60℃
水浴或自然挥去溶剂。用少许0．45N氢氧化钠溶液溶解，倒入25毫升容量瓶中，加0．45N 氢氧化钠至刻度，得每毫升含60微克巴比妥药物PHl4的标准液。取六个10毫升刻度试管，依次加入每毫升含60微克巴比妥药物PHl4标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0毫升，再依次分别加入0.45N氢氧化钠液5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0毫升，配成每毫升含标准药物10，20、30、40、50、60微克的PHl4碱液。
另取十二个10毫升的试管，分成两组，依次分别加入上面配制的每毫升标准药物10、20、30、40、50、60微克的PHl4碱液各2.0毫升。再于第一组试管中各加0.45N氢氧化钠液2.0毫升，即配成每毫升含速可眠等巴比妥类药物5、10、15、20、25、30微克的PHl4碱液；再于第二组试管中各加入0.6N硼酸－氯化钾缓冲液2.0毫升，即配成每毫升含速可眠等巴比妥药物5、10、15、20、25、30微克的PHl0碱液。取已配好的速可眠等巴妥类一系列不同浓度的PHl4和PHI0碱液，以相同PH值的碱液为参比，在紫外分光光度计上于190—270nm间测吸收图谱，算出260nm处的吸收差值。
(2)绘制标准曲线：
以PHl4和PHI0碱液于260nm处的吸收差值或PHl4和PH2于305nm处的吸收差值
△E为纵坐标，浓度(微克／毫升)为横坐标，在坐标纸上绘出直线，即得巴比妥类药物的标准曲线。巴比妥、戊巴比妥和速可眠的浓度在0--30微克／毫升之间成线性关系。
(3)检材中药物含量的测定
取0.45N氢氧化钠反提液，按下法分别配成PHl4和PHl0的溶液；
取2毫升反提液，加2毫升0.45N氢氧化钠溶液，混匀后即为PHl4检液。
取2毫升反提液，加2毫升0.6N的硼酸－氯化钾缓冲液，混匀后即为PHI0检液。
PHl4检液，以0.45N氢氧化钠作参比。
PHl0检液，以0.45N氢氧化钠和0.6硼酸－氯化钾缓冲液的混合液为参比。
分别在紫外分光光度计上从190到270nm间吸收，算出在260nm处的吸收差值。再从该药物的标准曲线中查得所含药物的浓度，计算出检材中药物的含量。
检材含药量W
W＝检材中的含药量（微克/克·毫升）
V c检材用0.45N氢氧化钠反提毫升数
C m=从标准曲线上检得的检液浓度（微克/毫升）
M＝所取检材克数
六、气相色谱法
1．应用填充柱技术，衍生化法
2．操作条件
检测器：FID
色谱柱：6英尺（或2米）2～4mmID玻璃柱
固定液：3％SE－30，80－100mm chromosorb G
载气：N2，45～50ml/min
柱温：190－200℃
进样/检测器温度：220℃
内标物：正烷烃
衍生化试剂：0.2M三甲基羟苯胺甲醇溶液
[方法]
内标溶液的配制：
用乙酸乙酯溶解一定量的正烷烃，配成1mg/ml的巴比妥酸类药物标准溶液。
[标准溶液的配制]
准确称取一定量的巴比妥类药物（游离酸），用内标溶液来配制成1mg/ml的巴比妥酸类药物标准溶液。
[样品溶液的配制]
称取一定量备用内标溶液来配制。内标和样品中巴比妥酸类药物的浓度都应大致在1mg/ml的范围内。
取1μl的标准溶液和1μl的衍生化试剂一并注入色谱柱中，利用在线的衍生化技术进行柱头衍生化，然后一起注入样品溶液和生化试剂，计算样品中巴比妥酸盐的浓度可利用下列式：
C X%= ××100
Cx％：样品中组分x的浓度(W／W％)
Cr.std：标准溶液中组分x的浓度(W／V％)
Csam：样品浓度(W／V％)
Ax：在样品峰中组分x的峰面积
Arstd：标准溶液色谱峰组分x的峰面积
Aint．std．in sam．chrom：样品峰中内标物的峰面积
附：试剂配制
1．配制磷酸钠溶液：5克磷酸二氢钠溶于100毫升水中。
2．1％硝酸钴乙醇液：l克无水硝酸钴溶于100毫升无水乙醇中。
3．吡啶氯仿液：1毫升吡啶加入9毫升氯仿混匀。
4．硫酸铜吡啶法：1份1％硫酸铜溶液和等量吡啶氯仿液混和。
5．硫酸汞试剂：5克氧化汞溶于20毫升浓硫酸中；然后将此缓慢加到水中，稀释至100毫升。
6．硝酸银丙酮液：l克硝酸银，用加有l％水的丙酮溶解，取其上清液使用，避光保存。
7．0.2％二苯卡巴腙试剂：0.2克二苯卡巴腙溶于100毫升氯仿。
8．0.45N氢氧化钠液：溶解18g氢氧化钠于水，并稀释达l升，贮在聚乙烯瓶中。
9．硼酸－氯化钾缓冲液：硼酸18.55克，氯化钾22.36克，加水溶解(需加热)至500毫升，过滤后使用。
10．PHl0缓冲液：等量的硼酸－氯化钾缓冲液和0.45N氢氧化钠液混合，即得。临用时配制。
吩噻嗪类药物的检测
目的要求：熟悉吩噻嗪类药理化性质，掌握分离提取原理和常规定性定量分析方法。
一、检材的采取
应以剩余药物、胃内容物或洗胃液及尿、血等作检材较好，因吩噻嗪类药物易分解，应避光保存。
二、检材的分离提取
1．分离原理：吩噻嗪类药物属碱性有机化合物，在碱性条件下可溶于有机溶剂中，而在酸性条件下形成盐类易溶于水。在毒物分析工作中，对含有吩噻嗪类药物的检材应在碱性条件下用有机溶剂提取，由于吩噻嗪类药物进入体内，部分与蛋白质或葡萄糖醛酸结合，以结合形式存在，一般的碱化检材，难以完全被有机溶剂分离提取，各有机溶剂对吩噻嗪类药物的溶解度各不相同，特别是氯丙嗪不易被氯仿提取，而多采用乙醚或庚烷作溶剂提取。
2．快速提取法
取尿或胃内容物50毫升，加10％氢氧化钠碱化至PH11－12，取乙醚50、30、20毫升分别提取三次，合并提取液，用无水硫酸钠脱水，活性碳脱色后置水浴上挥干，剩残渣供检测用。
3．盐酸水解法
血、肝、脑、肾等内脏组织，取20－40克剪碎加入等量浓盐酸，置沸水浴中加热1小时，再经60％氢氧化钠碱化后用乙醚或庚烷50－100毫升分三次浸提，合并提取液经无水硫酸钠脱水，活性碳脱色后，水浴上挥干溶剂，残渣供检测用。
4．乙醇冷浸提取法：
对高度腐败或肉泥状，含吩噻嗪又极少的检材可用碱性乙醇冷浸提取，即取检材20—40克，加氢氧化钠溶液呈碱性，加无水乙醇浸泡检材，充分摇匀，放置过夜，滤出无水乙醇。检材再用无水乙醇浸洗两次，过滤。合并醇液于水浴上蒸发至干。加0.1N盐酸30毫升溶解残留物，酸液置冰箱中冷冻，将油脂冻成块状后立即过滤，滤液用氢氧化钠液调至PH 为12，再用乙醚提取，浓缩乙醚至0.5毫升，供检验用。
三、颜色反应
1．三氯化铁－硫酸反应
直接取尿液1毫升，加入5％三氯化铁溶液0.5毫升，产生桃红色到紫红色。再加0.5毫升50％硫酸，颜色不消退，表示含有吩噻嗪类药物。
2．FPN试剂试验
(1)原理：吩噻嗪类分子结构中的苯骈嗪环，易被氧化剂氧化为红色的醌式衍生物。
(2)操作方法：取提取残渣少许，放在白瓷反应板中（或试管内）滴加FPN试剂1－2滴，如有氯丙嗪，异丙嗪及奋乃静则呈现洋红色，如有太尔登，三氟拉嗪出现橙红色。
四、薄层色谱法
1．薄层板
硅胶G或硅胶CMC薄层板
2．展开剂
（1）苯：醋酸乙酯：二乙胺（9：3：1）
（2）苯：环己烷：二乙胺（1.5：7.5：2）
3．显色
（1）50％硫酸－乙醇显色剂，显橙色至粉红色。
（2）FPN试剂：呈粉红色
50％硫酸－乙醇液作为显色剂，只有吩噻嗪类化合物与试剂产生反应，其还可以区别某种吩噻嗪类化舍物。如氯丙嗪与异丙嗪在此展开溶剂系统层析后色斑的Rf值较为接近，但它们的色斑与硫酸－乙醇液作用显色不同，可区别开来。
吩噻嗪类不稳定，易分解，除出现原药斑点外，其代谢产物斑点也同时出现，故有时可同时出现两三个斑点，此时，可先将原点处的斑点加1：1硝酸1滴，以能盖住原点为度，使检品及标准样品全部氧化为亚砜。但一般亚砜显色较慢，可在紫外线下照射2－3分钟后即可显色，待红色斑点退色后，吹干水分，再用上述溶剂展开，显色。
4．测量计算判断结果
试剂配制
1．0.1N盐酸溶液：8.33毫升浓盐酸用水稀释至100毫升。
2．FPN试剂：5％三氯化铁1毫升，20％过氯酸9毫升，50％硝酸10毫升，混合即可。
3．50％硫酸－乙醇液：50％硫酸40毫升，无水乙醇10毫升混合配制。
苯骈二氮杂卓类药物的检测
目的要求：了解苯二氮卓类药物的理化性质，掌握其分离提取原理和常规的检测方法。
一、检材采取
应以中毒者的剩余食物、饮料，初次洗胃液、血、尿为理想检材。
二、检材的分离提取
1．分离原理：苯二氮卓类药物包括安定、舒乐安定、三唑仑、阿普唑仑等，在酸性条件下成盐溶于水，一般在弱碱性环境下易被提取，由于安定、三唑仑、阿普唑仑等在乙醚中的溶解度极小，因此在提取时常选用氯仿等溶剂。
2．快速提取：取尿或胃内容物50毫升，加浓氨水碱化至PH8－9，用氯仿50、30、20毫升分别提取三次，合并提取液于蒸发皿中，用无水硫酸钠脱水，活性炭脱色后置水浴上挥干，剩残渣供检测用；对尸体脏器检材，先将其捣碎，加氨水调PH8－9，加无水硫酸钠将检材研磨至粉渣状，再以如上方法提取净化。
三、颜色反应
1．原理：本类药物与碘化铋钾试剂反应产生橙红色沉淀，但许多物质都有此反应，因此专属性不强，只能作为预试验用。
2．操作方法：
用1毫升氯仿溶解上述残渣后，用毛细点样管吸收少部分，滴加在薄层板上，干后，
滴加一滴碘化铋钾试剂，此时含苯二氮卓类药物的斑点显桔黄色。
四、薄层色谱法
1．薄层板
硅胶G或CMC薄层板
2．点样
将提取残渣与标准品分别用毛细点样管点在薄层板上，然后放入层析缸展开剂中进行展开。
3．展开剂
(1)氧仿：丙酮(9：1)
(2)甲苯：丙酮：无水乙醇：氨水(9：9：1.6：0.4)
4．显色
碘化铋钾——显桔黄色
操作方法：当层析后取出薄层板晾干，用喷瓶均匀地喷上碘化铋钾试剂，此时苯二氮卓类药物显桔黄色斑点。将样品与标准品斑点进行对照，量出Rf值，判断结果。
五、安定的含量测定一紫外分光光度法
1．原理：安定在2—20微克／毫升浓度范围内，其242nm和263nm处的光密度差值与浓度成正比。
2．试剂：
3M磷酸盐溶液：41.4克NaH2PO4·H2O加水溶解至100毫升。
氯仿(或乙醚)
0．45N氢氧化钠溶液
正已烷
2N盐酸溶液
安定标准溶液
3．操作
(1)取检材5克或5毫升，捣碎后，加3M磷酸盐溶液0.25毫升，用氯仿30－50毫升振摇提取，分出氯仿液。检材再用10－20毫升氯仿提取一次，合并氯仿液。
(2)氯仿液用10毫升0.45N氢氧化钠溶液洗涤一次，弃去碱液，再用水洗一次。
(3)氯仿液通过干燥的滤纸，滤入蒸发皿中，挥干（如用乙醚提取，需用无水硫酸钠脱水后挥干）；
12生物制药工艺学习题集 制备型高效液相色谱技术
第十二章制备型高效液相色谱技术 一、填空 1制备型高效液相色谱的重要参数：、、、 2色谱介质按分离机理分为、、、、、 3蛋白质分离的主要依据有、、、。 二、选择题 1用UV检测器进行多肽检测时常用的检测波长为：（） A 214nm B 320nm C 450nm D 500nm 2在高效液相色谱中,六通阀属于 ( ) A. 进样系统 B. 分离系统 C. 检测系统 D. 数据处理系统 三、名词解释 1容量因子： 2分离度： 四、问答题 1 制备型HPLC与分析型HPLC的主要不同点是什么？ 2简述制备型高效液相色谱常见问题及解决办法 3一般来讲在设计分离方案时应考虑哪些事项？
第十二章 制备型高效液相色谱技术 （答案） 二、 填空 1分离度、分离速度、回收率、样品载量 2反相色谱、 正相色谱、 离子交换色谱、 凝胶过滤色谱、亲和色谱 。 3分子量、等电点、疏水性、结构特异性 。 二、选择题 1（A ） 2 ( A ) 三、名词解释 1是色谱分析中的重要参数，定义为溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。当色谱柱、溶剂和分离温度一定时，容量因子为常数。 2在色谱分析中,表示各组份之间分离程度的参数.其定义为相邻两色谱峰保留值之差与峰底宽之和一半的比值. 2 121)(2)(21121 2W W t t W W t t R r r r r +-=+-= 四、 问答题 1 （1）输液泵不同： 两种泵设计的特点及其性能 （2）检测器中的检测池不同 （3）色谱柱不同：主要是色谱柱的直径大小不同以及填料的粒径的大小不同 （4）制备色谱一般配有电导检测器和pH 值检测器分析型色谱没有 （5）制备色谱一般配备收集器分析型色谱没有 2（1）待分离成分呈单一主峰 （2）不易分开的两组分 （3）目的组分含量少 3 （1） 产品的最终用途是什么?
实验一薄层层析板的制备
实验一薄层层析板的制备 一、实验目的 制备薄层层析板，使叶绿素在层析板上分离显色。 二、实验原理 薄层层析，常用 TLC（Chromatography）表示，又称薄层色谱，属于液－固吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01 μ g ）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达 500mg 的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。 薄层吸附色谱的吸附剂最常用的是氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺和纤维素。其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。硅胶是无定形多孔性物质，略具酸性，适用于酸性物质的分离和分析。薄层色谱用的硅胶分为：“硅胶H ”—不含粘合剂；“硅胶G ”—含煅石膏粘合剂；“硅胶HF 254 ”—含荧光物质，可用于波长为 254nm 紫外光下观察荧光；“硅胶GF 254 ”—既含煅石膏又含荧光 剂等类型。粘合剂除上述的煅石膏（半水合硫酸钙： 2CaSO 4 · H 2 O ）外，还 可用淀粉、羧甲基纤维素钠。 三、实验材料、器具 1、试剂硅胶、4‰的CMC溶液（羧甲基纤维素钠） 2、实验用具：药匙、研钵、载玻片、量筒、玻棒 四、实验步骤 1、载玻片要求平滑清洁，没有划痕，在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤，再用水冲洗干净。（干净的标准：水不是呈股流下，而是呈瀑布状态流下。） 2、与硅胶混合：CMC－Na溶液与硅胶的比例为3:1(3ml：1g)。取CMC－Na溶液倒入研钵中，然后加入硅胶，在研钵中研磨，按一个方向研磨，自下而上，然后自上而下，以赶尽气泡为佳。 3、铺板：将载玻片置于平台上，用药匙舀取糊状硅胶，均匀地铺在载玻片表面。铺板时，可以顺着板中间倒，也可以顺着某个边缘倒，也可以用玻璃棒引着溶液平铺在玻璃板上，倒时也要注意不要引入小气泡。尤其是载板的四个角，容易高出玻璃板其他部位，所以要格外注意。后轻颠几下薄层板即可。颠好的板，表面看上去要光滑平整，没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在平的台面上，否则难保证板面硅胶的厚度均匀。（3g硅胶大约可铺7.5×2.5cm载玻片5-6块） 4、晾干：置水平台上于室温下晾干。 5、活化：将晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min，然后取出，放入干燥器中，备用。活化硅胶有利于提高硅胶的吸附性能，同时排除硅胶内部已吸收的水分及其他气体。通过活化硅胶，主要改变了硅胶内部的微孔结构，使其孔径的大小及
薄层色谱法实验报告
实验报告 一、实验目的 掌握薄层色谱的基本原理及其在有机物分离中的应用。 二、实验原理 有机混合物中各组分对吸附剂的吸附能力不同，当展开剂流经吸附剂时，有机物各组分会发生无数次吸附和解吸过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前，而吸附力弱的组分则滞后，由于各组分不同的移动速度而使得她们得以分离。物质被分离后在图谱上的位置，常用比移值R f表示。 R f 原点至层析斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离 三、实验仪器与药品 5.0cm×15.0cm硅胶层析板两块，卧式层析槽一个，点样用毛细管。 四、物理常数 五、仪器装置图
“浸有层析板的层析槽”图 1-层析缸，2-薄层板，3-展开剂饱和蒸汽，4-层析液 六、实验步骤 （1）薄层板的制备： 称取2～5g层析用硅胶，加适量水调成糊状，等石膏开始固化时，再加少许水，调成匀浆，平均摊在两块5.0×15cm的层析玻璃板上，再轻敲使其涂布均匀。（老师代做！）固化后，经105℃烘烤活化0.5h，贮于干燥器内备用。 （2）点样。 在层析板下端2.0cm处，（用铅笔轻化一起始线，并在点样出用铅笔作一记号为原点。）取毛细管，分别蘸取偶氮苯、偶氮苯与苏丹红混合液，点于原点上（注意点样用的毛细管不能混用，毛细管不能将薄层板表面弄破，样品斑点直径在1~2mm为宜！斑点间距为1cm） （3）定位及定性分析 用铅笔将各斑点框出，并找出斑点中心，用小尺量出各斑点到原点的距离和溶剂前沿到起始线的距离，然后计算各样品的比移值并定性确定混合物中各物质名称。
实验注意事项 1、铺板时一定要铺匀，特别是边、角部分，晾干时要放在平整的地方。 2、点样时点要细，直径不要大于2mm,间隔0.5cm以上，浓度不可过大，以免出现拖尾、混杂现象。 3、展开用的烧杯要洗净烘干，放入板之前，要先加展开剂，盖上表面皿，让烧杯内形成一定的蒸气压。点样的一端要浸入展开剂0.5cm 以上,但展开剂不可没过样品原点。当展开剂上升到距上端0.5－1cm 时要及时将板取出，用铅笔标示出展开剂前沿的位置。 讨论： 七、思考题
薄层色谱 的详细步骤
. 薄层色谱分析步骤详解 薄层色谱法(thin layer chromatography简写TLC)是一种物理化学的分离技术，常用于药物的分离与分析。现对此方法的分析步骤及留意事项提点建议。 完成TLC分析通常需经制板、点样、展开、检出4步操纵。 ⑴制板 在一平面支持物(通常为玻璃)上，均匀地涂制硅胶、氧化铝或其他吸附剂薄层、样品的分离、检测就在此薄层色谱板上进行。 一般选用适当规格的表面光滑平整的玻璃板。常用的薄层板规格有：10cm×20cm、5cm×20cm、20cm×20cm等。称取适量硅胶，加进0.2％～0.5%羧甲基纤维素钠溶液（CMC-Na），充分搅拌均匀，进行制板。一般来说10cm×20cm的玻璃板，3～5g硅胶/块；硅胶与羧甲基纤维素钠的比例一般为1：2～1：4。制好的玻璃板放于水平台上，留意防尘。在空气中自然干燥后，置1l0℃烘箱中烘0.5～lh，取出，放凉，并将其放于紫外光灯(254nm)下检视，薄层板应无花斑、水印，方可备用。 ⑵点样 用微量进样器进行点样。点样前，先用铅笔在层析上距末端lcm 处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，假如要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过大。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm.底线距基线1～2．5cm，点间间隔为lcm左右，样点与玻璃边沿间隔至少lcm，为防止边沿效应，可将薄层板两边刮往1～2cm，再进行点样。 ⑶展开 将点了样的薄层板放在盛在有展开剂的展开槽中，由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至一定间隔后，取出薄层板，样品组分固移动速度不同而彼此分离。 ①展开室应预饱和。为达到饱和效果，可在室中加进足够量的展开剂；或者在壁上贴两条与室一样高、 宽的滤纸条，一端浸进展开剂中，密封室顶的盖。 ②展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时新配为宜。 ③薄层板点样后，应待溶剂挥发完，再放人展开室中展开。 ④展开应密闭，展距一般为8～15cm。薄层板放进展开室时，展开剂不能没过样点。一般情况下，展开剂浸进薄层下真个高度不宜超过0.5cm。 ⑤展开剂每次展开后，都需要更换，不能重复使用。 ⑥展开后的薄层板用适当的方法，使溶剂挥发完全，然后进行检视。 ⑦Rf值一般控制在0.3～0.8，当Rf值很大或很小时，应适当改变活动相的比例。 ⑷斑点的检出 展开后的薄层板经过干燥后，常用紫外光灯照射或用显色剂显色检出斑点。对于无色组分，在用显色剂时，显色剂喷洒要均匀，量要适度。紫外光灯的功率越大，暗室越暗，检出效果就越好。 展开分离后，化合物在薄层板上的位置用比移值(Rf值)来表示。化合物斑点中心至原点的间隔与溶剂前沿至原点的间隔的比值就是该化合物的Rf值。 ;.
高效液相色谱的应用与发展前景
高效液相色谱的应用呵发展前景 液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过 改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快. 分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC) HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。 高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。 对于高效液相色谱的发展前景应该是非常乐观的，现在的社会的发展节奏很快，各个领域对于分析检验的需求很多，而分析检验中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。所以她的发展情景很乐观。理由有几点 1，随着科技的发展，技术的日臻完善，较之以前色谱分析的方法有了很大程度的提高，很多科学家在对于一些分析上的难点有了新的突破，这样一个 不断完善的技术在以后的社会发展中一定会扮演着一个重要的角色。 2，最近,一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相色谱分析法上,使得高效液相色谱的应用更广泛,并充分利用高效快速.选择性好.灵敏度高等优 点,建立更加系统的成分分析方法.通过与质谱联用.梯度洗脱.柱切换技 术.配合先进的检测技术,以及与分子生物学.现代分子药理学相结合,必
薄层色谱TLC(点板)的基本原理
薄层色谱(点板)的基本原理 ★★ 薄层色谱，或称薄层层析(thin—1ayer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，从50年代发展起来至今，仍被广泛采用。 (一)基本原理 薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。
物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。 例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的Rf值（后面介绍Rf值）对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法
薄层色谱法
薄层色谱法 薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。 1.仪器与材料 （1）薄层板 按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。固定相中可加入黏合剂、荧光剂。硅胶薄层板常用的有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254，G、H表示含或不含石膏黏合剂。F254为在紫外光254nm 波长下显绿色背景的荧光剂。按固定相粒径大小分为普通薄层板（10～40μm）和高效薄层板（5～10μm）. 在保证色谱质量的前提下，可对薄层板进行特别处理和化学改性以适应分离的要求，可用实验室自制的薄层板。固定相颗粒大小一般要求粒径为10～40μm。玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。 （2）点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。 （3）展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。水平展开用专用的水平展开缸。 （4）显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。 （5）检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。 （6）薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或
经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。 2.操作方法 （1）薄层板制备 市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。 自制薄层板除另有规定外，将1份固定相和3份水（或加有黏合剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，无麻点、无气泡、无破损及污染。 （2）点样除另有规定外，在洁净干燥的环境，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上，一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边10～15mm，高效板一般基线离底边8～10mm。圆点状直径一般不大于4mm，高效板一般不大于2mm；接触点样时注意勿损伤薄层表面。条带状宽度一般为5～10mm。高效板条带宽度一般为4～8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。 （3）展开将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开8～15cm，高效薄层板上
高效液相色谱习题和答案解析
高效液相色谱法习题 一、思考题 1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么? 10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？ 13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理 14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？ 16．以液相色谱进行制备有什么优点？ 17．在毛细管中实现电泳分离有什么优点？ 18．试述CZE的基本原理 19．试述CGE的基本原理 20．试述MECC的基本原理 二、选择题 1．液相色谱适宜的分析对象是（）。 A 低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物 D 所有化合物 2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。 A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相钻度较小 D 柱温低 3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL －1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。 A mA/m B B mB/mA C CB/CA D CA/CB。 4．液相色谱定量分析时，不要求混合物中每一个组分都出峰的是＿。 A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 5．在液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（）是有效的？ A 改变流动相种类 B 改变固定相类型 C 增加流速 D 改变填料的粒度 6．在分配色谱法与化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）。 A 提高分配系数比 B 容量因子增大 C 保留时间增长 D 色谱柱柱效提高 7．分离结构异构体，在下述四种方法中最适当的选择是（）。 A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．分离糖类化合物，选以下的柱子（）最合适。 A ODS柱 B 硅胶柱 C 氨基键合相柱 D 氰基键合相柱 9．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）。 A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 10．在高效液相色谱中，采用254 nm紫外控制器，下述溶剂的使用极限为（）。 A 甲醇210 nm B 乙酸乙醋260 nm C 丙酮330 nm 11吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用（）。 A 液一液色谱法 B 液一固色谱法 C 键合相色谱法 D 离子交换法 12．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为（）。
薄层色谱法在药物分析中的应用
1 薄层色谱法概述 (2) 1.1 定义 (2) 1.2 原理 (2) 1.3 特点 (2) 1.4 定量检测方法 (3) 2 TLC在药物分析方面的应用 (3) 2.1 中药材的鉴别 (3) 2.2 植物药成分的鉴别 (4) 2.3 化学药品及复方制剂 (5) 2.4 药品杂质检验 (6) 2.5 中药指纹图谱分析 (6) 2.6 在定量分析中得应用[13] (7) 2.6.1 薄层色谱定量方法 (7) 2.6.2 薄层色谱在定量分析中得应用 (8) 3 薄层色谱新技术及其应用 (8) 3.1 高效薄层色谱（HPTLC） (8) 3.2假相薄层色谱 (9) 3.3 反相薄层色谱( RPTLC) (10) 3.4 薄层扫描法[17] (11) 4 总结 (12)
薄层色谱在药物分析中的应用 薄层色谱( Thin Layer Chromatography，TLC) 在药物，尤其在植物药成分的定性和定量分析方面早已有了非常广泛的应用。随着科学技术的发展以及新材料的应用，使其得到了很大发展，出现了许多新技术，如高效薄层色谱、假相薄层色谱、反相薄层色谱、微乳薄层色谱在中药药物分析中已有一定的应用。TLC 在规范化、仪器化方面均取得了长足的进步，在大批量样品及某些特殊样品的快速分析中，显示了分析容量大、可采用特征专属的显色剂以及极低的溶剂消耗等优势。近年来TLC 广泛应用于有机化合物的分析鉴定、植物药有效部位的分离精制、有机合成、结构分析、生物测定等，尤其在研究开发植物药有效部位和中成药质量控制中，是用于定性、定量分析的最简便的科学方法。但TLC亦有其缺陷，其色谱结果易受铺板质量、点样技术、展开剂配制、层析环境中展开剂的饱和度、环境温湿度等因素的影响，有时难于重复；显色又受均匀性、灵敏度、稳定性等影响，这均使测定结果偏差较大[1]。最近几年围绕着测定过程的标准化和自动化，薄层色谱技术有了全新的发展，扩大了TLC技术在中药药物定性定量分析中的应用。 1 薄层色谱法概述 1.1 定义 薄层色谱法（TLC）系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上, 成一均匀薄层。待点样，展开后, 根据比移值(Rf) 与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(Rf ) 作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。 1.2 原理 薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相(溶剂) 流过固定相(吸附剂) 的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附, 从而达到各成分的互相分离的目的。 1.3 特点 薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也
使用制备型高效液相色谱的经验之谈之欧阳光明创编
案例一:某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。 欧阳光明（2021.03.07） 解决方法：终极目的是提纯该物质。总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法。由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型. 高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。 方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC 条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。 更细致地来讲，开始Preparative HPLC 之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV 光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS 检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC 之前是否须经flash column
粗分）； 样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等； 建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC 相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），若流动相中必须添加改性剂，应尽量避免非挥发性的缓冲盐，优先选择易挥发性缓冲液（例如甲酸、乙酸、三氟乙酸、甲酸铵、乙酸铵、三乙胺、氨水等），否则要脱盐，得二次分离； 优化Preparative HPLC 条件——通常来讲，制备柱是实验室现有的（色谱柱就这么定下来了，没得选择的余地，除非是需新购色谱柱），在Analytical HPLC 的基础上优化梯度分离方法、考察进样量、目标组分收集确认（LC-MS 测分子量）； 检查出现的问题——这一步是最需要费心留神的！很多时候，出了问题，根本就没有挽回的余地，当然了，有时也是亡羊补牢，犹为未晚；所以，更多的时候，是需要未雨绸缪，把可能会发生的事情尽量考虑周全！比如样品的溶解度（在甲醇、水、乙腈、流动相、四氢呋喃那、酸水、碱水中的溶解性如何？），若样品溶解性不好，第一步就卡住，很打击人滴！ 曾遇到过这么个实例——一个某种酶抑制剂，含氮杂环类化合物，在上面提到的那些溶剂中 溶解度都相当地小，analytical HPLC 虽然分离得很漂亮，但还是没
薄层色谱法标准操作规程
薄层色谱法标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 内容： 1 简述：薄层色谱法，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。等点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。 2 仪器与材料： 2.1 玻板：除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑，平整、洗净后的不附水珠，晾干。 2.2 固定相或载体：最常用的有硅胶G、硅胶GF、硅胶H、硅胶HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。其颗粒大小，一般要求直径为10—40μm。薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种；前者系将固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10—15%煅石膏（CaSO4·2H2O在140℃烘4小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5—0.7%）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定展开液或缓冲液的薄层。 2.3 涂布器：应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。 2.4 点样器：常用具支架的微量注射器或定时毛细管，应能使点样位置正确集中。 2.5 展开室：应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有
严密盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。 3 操作方法： 3.1 薄层板制备：除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2—0.3mm），取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。 3.2 点样：除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边 2.0cm，点样直径为2——4mm，点间距离约为1.5—2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。 3.3 展开：展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为10—15cm），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测，如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄
薄层色谱分析步骤及注意事项经典.doc
薄层色谱分析步骤及注意事项 薄层色谱法(thin layer chromatography简写TLC)是物理化学的分离技术，常用于药物的分离与分析现对此方法的分析步骤及注意事项提点建议。 薄层色谱分析步骤[最新*#~新@] 完成TLC分析通常需经制板、点样、展开、检出4步操作。[最新版%新&@] ⑴制板 在一平面支持物(通常玻璃)上，均匀地涂制硅胶、氧化铝或其他吸附剂薄层、样品的分离、检测就在此薄层色谱板上进行。 一般选用适当规格的表面光滑平整的玻璃板。常用的薄层板规格有：10cm×20cm、5cm ×20cm、20cm×20cm等。称取适量硅胶，加入0.2％～0.5%羧甲基纤维素钠溶液（CMC-Na），充分搅拌均匀，进行制板。一般来说10cm×20cm的玻璃板，3～5g硅胶/块；硅胶与羧甲基纤维素钠的比例一般为1：2～1：4。制好的玻璃板放于水平台上，注意防尘。在空气中自然干燥后，置1l0℃烘箱中烘0.5～lh，取出，放凉，并将其放于紫外光灯(254nm)下检视，薄层板应无花斑、水印，方可备用。 ⑵点样 用微量进样器进行点样。点样，先用铅笔在层析上距末端lcm 处轻轻画一横线，然后用毛细管吸取样液在横线上轻轻点样，如果要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm.底线距基线1～2．5cm，点间距离为lcm左右，样点与玻璃边缘距离至少lcm，为防止边缘效应，可将薄层板两边刮去1～2cm，再进行点样。 ⑶展开 将点了样的薄层板放在盛在有展开剂的展开槽中，由于毛细管作用，展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至一定距离后，取出薄层板，样品组分固移动速度不同而彼此分离。 [最新@&新#*]
天然产物制备技术
天然产物制备技术 所谓制备色谱是指待分离的样品数量在 g与g之间，分为分析型、半制备、制备型三种。 对于制备型高压液相色谱分类方法有不同观点： 例如对于高压液相色谱snyder和kirkland（1979）根据色谱柱能分离样品的量将其分为分析型（多孔型吸附剂，1～2mg，15min可分开两个分辨率Rs＝1.25 的化合物，回收纯度>99%）,半制备型（100～200mg）和制备型（0.5～1.0g）三种。还可增加生产型色谱，即指那些样品量在几百克到几千克之间的分离。Herbert（1991）限定制备型色谱为样品量在克数量级，柱直径在25～150mm之间的分离，而生产型色谱为所用柱直径大于150mm的分离。所以对制备型一词范围，分离样品量之间存在显著的差别。 选择制备型分离系统时，不仅仅要考虑待分离样品的量，还应考虑拟进行的分离的种类。充分考虑上述因素并正确选择色谱柱、尺寸、固定相种类以及流动相流速等参数才能保证分离和制备的成功。根据以往工作经验，往往采用两个步骤来完成分离工作，选用低分辨率、快速分析柱进行粗分（其中可除去色素、鞣质等杂质）再用HPLC高分辨率色谱柱进行细分。 一、基本原理 液相色谱的效能取决于分离速度和分辨率，对于制备型加压液相色谱而言，上样量是一个重要指标。 对于某个分离参数进行优化，往往会影响其它分离参数，例如：增加洗脱液流速会降低分辨率（Rs），分辨率会因上样量过大而下降，上样量过大的原因包括样品溶液的体积过大或浓度过大，色谱柱的载样量又取决于柱的直径、长度、固定相颗粒大小以及装填的紧密程度。 对于偶尔的一次分离而言，其主要的目的是得到一定量的某个化合物，达到一定纯度和回收率。而对于生产规模的色谱分离而言，单位时间内可分离的样品量是一个关键指标，单位时间获得样品量即产量，取决于色谱柱直径和洗脱液流速等参数，生产能力和样品纯度是
薄层层析方法与注意问题
薄层层析 薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上，成为薄层，把样品点到薄层上，用适宜的溶剂展开，从而使样品各组分达到分离的层析技术。如果支持剂是吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺等，则称之为薄层吸附层析；如果支持剂是纤维素、硅藻土等，层析时的主要依据是分配系数的不同，则称之为薄层分配层析；同理，如果支持剂是离子交换剂，则称为薄层离子交换层析；薄层若由凝胶过滤剂制成，则称为薄层凝胶层析。 薄层层析的操作与纸层析相似，但比纸层析速度快，一般仅需15-30min，分辨力比纸层析高10-100倍，它既能分离0.01μg的微量样品，又能分离500mg 基至更多的样品作制备用。薄层的制备可规格化，样品滴加后可立即展开，不受温度影响。其缺点是Rf值的重现性比纸层析差，对生物大分子物质的分离效果不大理想。 一、支持剂的选择与处理 薄层层析的支持剂种类很多。使用时应根据欲分离物质的种类进行选择。 支持剂颗粒大小要适当。颗粒大，展开速度快。但颗粒过大时，分离效果不好；而颗粒过小，则展开速度太慢，容易出现拖尾现象。一般有机类支持剂如纤维素粉的颗料为70-140目(直径0.1-0.2mm)，薄层厚度为1-2mm；无机类支持剂如氧化铝、硅胶等的颗粒一般为150-300目，薄层厚度为0.25-1mm。 在薄层层析中，使用较多的是硅胶、氧化铝等吸附剂，其处理方法同吸附柱层析。同样，用离子交换剂，凝胶过滤剂等为支持剂时，支持剂均要按柱层析处理填料的相应方法处理。 二、薄层板的制作 支持板要表面平整、光滑，用前应洗净、干燥。 常用的薄层板有硬板(湿板)与软板(干板)之分。在支持剂中加入粘合剂(锻石膏、淀粉、羧甲基纤维素钠盐等)，调成糊状物所制成的薄层板为硬板，用粉状支持剂直接制成的薄层板为软板。硬板粘牢在支持板上，调成糊状物喷显色剂时不会冲散，可以直立展开，而软板只能接近水平展开。
薄层色谱板的制备和使用
实验一薄层色谱板的制备和使用 目的要求： 通过实验进一步理解薄层色谱技术理论，熟悉掌握薄层色谱板的制备和使用方法。 一、薄层层析的基本原理 把吸附剂（固定相）均匀地铺在一块玻璃板上，将待分离的样品溶液点加在一薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相）展开，由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同及溶剂对不同物质溶解分配系数不同，当溶剂流过时，各物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附，解吸附，再吸附，再解吸附。不易被吸附或易被溶剂溶解的物质相对移动得快一些。经过一段时间的展开，不同的物质被彼此分开，最后形成相互分离的斑点。将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，应用特定的试药或方法将斑点显色，从而达到定性和定量的目的。 二、薄层板的制备 1．玻璃板 用一块玻璃板涂上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等，玻璃板要求薄厚一致，大小相同，表面光滑平整，一般玻璃只要合乎这些要求就可。如果找不到平整均一的，将旧光学照像底片截成同样大小也可以。用前先将玻璃用肥皂和水洗干净，必要时浸泡在清洗液中，然后水洗烤干，用纱布擦光。 玻璃板大小有各种规格，一般有20×20、20×10、20×5厘米，也有更小的，可根据需要自行设计。宽度要求至少能点开两三个样品，每两点之间相隔至少1.5厘米，玻板长度一般要满足展开10厘米的距离。点样的起点应距底边至少1.5厘米的距离。 2．吸附剂 应用最广泛的为硅胶和氧化铝，市场上有专供薄层色谱用的吸附剂，规格分不含粘合剂的硅胶H，氧化铝H和含有粘合剂熟石膏的硅胶G，氧化铝G，如市售硅胶G含13％熟石膏，氧化铝分中性、酸性、碱性三种。吸附剂的粒度范围最好在180－200目之间，太小了流速慢，太大则影响分离效果。如不合要求，应过筛。 3．薄层板的涂布 最简单的涂布方法是用两条比玻璃板厚0．25毫米的玻璃条或有机玻璃条（或在同样厚度的玻璃条下粘一层胶布），将玻璃板夹住，把调好的吸附剂浆液平铺在薄层板上，然后用一有机玻璃条或直尺，迅速均匀地向前推进，就象推血片一样，只要推进的速度均匀一致，
反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题
成也萧何，败也萧何？！ ——反相制备型高效液相色谱法分离纯化过程中的共性问题 内容概览： 本文拟通过一个具体实例来介绍制备型高效液相色谱法的特点、影响制备型高效液相色谱分离纯化的因素，及其在合成药物、中药化学对照品研究中的实际应用，并对制备HPLC分离纯化过程中的共性问题做了总结并提出解决方案。 实际应用：某合成药物最终产品的纯化，对其纯度的要求——HPLC-UV法，210 nm & 254 nm 下，以峰面积归一化法，≥98.0%，同时需提供MS、NMR数据。 具体问题：某特定化合物系强极性有机小分子，极性大、难挥发，采用硅胶柱层析不易提纯，需用其他分离技术来纯化。 解决方法：终极目的是提纯该物质。总体策略——“先看，后想，再行动”——“看化学结构，想理化性质，定纯化方法”。由于该化合物及相关杂质的理化性质决定了难以用常规的重结晶、蒸馏（精馏）、硅胶柱层析来分离纯化。结合实验室的具体条件，考虑采用反相制备型高效液相色谱法（Preparative HPLC）来分离纯化之。 方法步骤：1.了解样品及有关组分的情况→2.样品预处理→3.建立Analytical HPLC Method→4.优化Preparative HPLC条件→5.检查出现的问题→6.回收纯化的物质。 更细致地来讲，开始Preparative HPLC之前须明白：待分离样品及有关组分的信息——所含化合物的结构信息（重点关注酸、碱性等极性基团）、UV光谱图（涉及到后续试验检测波长设定）、分子量（分离后目标化合物LC-MS检测确认）、待分离体系的复杂程度（所含化合物的数目，preparative HPLC之前是否须经flash column粗分）； 样品预处理——最主要的是样品的溶解度（将尽量多的样品溶于体积相对较小的溶液中）以及待分离体系里是否含强酸、强碱性物质（潜在的“柱杀手”），样品溶液是否需要中和等； 建立Analytical HPLC Method——这一步，跟平常的HPLC相似，重点关注待分离的目标化合物，使该物质与其前、后组分分离得尽量相隔远些（起码得基线分离，利于后续制备时放大），
薄层色谱技术
1.薄层色谱技术 概述 中药是祖国医药宝库的重要组成部分，是祖国传统医学赖以防病治病的主要物质基础。中药的真伪优劣直接关系到人民用药的安全和有效。在检验中药真伪方面通常采用的检测手段有形态鉴别、理化鉴别和光谱色谱分析等。而作为色谱技术一个分支的薄层色谱由于其独具的长处而被广泛应用于中药分析。层鉴别作为法定的检验项目是各级药品检验部门和药品生产、经营部门的质检人员检验中药的强制性检验项目。在可预见的将来，薄层色谱技术仍将是中药鉴别最主要的手段之一。无须赘言，如同其它色谱技术一样，一个样品分析结果好坏，取决于能否得到一个分离度和重现性良好的色谱。为了更好地执行国家药典中药薄层鉴别项目，中药检验室基本设备和配套和检验人员操作技术的规范化是获得较高质量的薄层色谱最基本的要求。 薄层色谱分析与其他色谱分析相比，其显著不同之一是得到的图谱是直观性很强的图象。一个比较复杂的中药薄层色谱，尤其是成分未明而斑点较多的薄层色谱往往是很难用文字描述的；何况药典正文因体
例的限制，也不可能作过多的文字叙述。 关于同一品种的药材商品的个体差异，如何判断的问题。在实际的样品分析中，的确存在着由于商品个体差异，致使薄层色谱难以和对照药材和色谱完全吻合。其实，在药材的形态鉴别中，这是司空见惯的问题，只要鉴别特征可靠，基础工作比较扎实，一般不会由于个体之间的形态差异而无法判断。因为同一品种的不同个体虽然有差异（即使对照药材也有这个问题），但是既然是同一品种，也必然存在着共性特征。外在的形态是如此，反映内在成分的色谱也是如此。譬如有无牲成分就是共性，如黄连均含小檗碱，小檗碱的有无固名可以作为黄连真伪鉴别的依据，但小檗碱未必就是黄连的问题。所以观察完整的色谱结合特征成分的辨认，就进一步提高了鉴别的准确度；经过比较，取大同弃小异，做出合理的判断。对于分布地区广泛，商品规格较多的品种，需要反复比较；有些品种个体之间成分变异较大，需要做大量的基础研究，掌握规律，方可设立对照药材，不能一蹴而就，所以药典中并非所有的品种都设有对照药材。在中药制剂中，由于制备工艺的不同或成分之间的相互干扰，图谱常常不能与原药材的色谱完全吻合，这就是更需要分析人员有较强的判断能力
TLC(薄层层析色谱)技术原理与应用
TLC（薄层层析色谱）技术原理与应用 一、薄层层析（TLC）简介 薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。 薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。 根据分离的原理不同，薄层层析可以分为两类：用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶；用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析。 吸附TLC→固定相为吸附剂→氧化铝、硅胶。（较多用） TLC→ 分配TLC→固定相为液态（通常为水）→固定相吸附在支持剂上。 （一）吸附薄层的基本原理： 吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。 吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。 1.吸附薄层层析：在硅胶薄层板上，样品中的两成分是两种结构近似的染料，在展开剂四氯化碳的作用下。在展开剂和薄层板之间不断地产生吸附、解吸，再吸附，再解吸，……。由于对氨基偶氮苯的极性比偶氮苯的极性稍强一些，层析的结果，对氨基偶氮苯受到的吸附作用稍强于偶氮苯，从而将两者分离。 展开结束以后，会在薄层板上形成两个斑点，混合物中的成分得以分离。
中药中的有效成分复杂多样，结构近似者不少。特别是对未知结构的成分分析，设计并摸索出合理的层析条件是首要任务。只有先设计出可用的层析条件，再经摸索改进，才可能对未知或者已知成分进行成功地分离。然后才能谈得上进一步的分析研究。 要设计出合理有效的层析条件，必须熟悉薄层层析条件的选择的基本要领。下面对薄层层析条件的选择做一初步介绍。 薄层层析的三项基本构成物质是：样品组分、吸附剂、展开剂。摸索层析条件，实际上是协调上述三者的关系，寻求一种能够有效分离样品组分的配合方案及实际操作要领。很明显，一切层析都是针对分析任务，也就是围绕待分离的样品组分来进行调整适应的。可见，层析条件的选择是以样品中的各组分为中心，适当调适展开剂的吸附剂的极性来实现的。（二）薄层层析条件的选择： 1.概述： 吸附剂的选择：薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂（支持剂）的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀。用于薄层层析的吸附剂或预制薄层一般活度不宜过高，以Ⅱ～Ⅲ级为宜。而展开距离则随薄层的粒度粗细而定，薄层粒度越细，展开距离相应缩短，一般不超过10厘米，否则可引起色谱扩散影响分离效果。 展开剂的选择：薄层层析，当吸附剂活度为一定值时（如Ⅱ或Ⅲ级），对多组分的样品能否获得满意的分离，决定于展开剂的选择。中草药化学成分在脂溶性成分中，大致可按其极性不同而分为无极性、弱极性、中极性与强极性。 基本思路是根据待分离样品组分的极性来确定吸附剂的极性（类型、活化度）和展开剂的极性（主要溶剂、调节溶剂、辅助溶剂等）。要协调、处理好吸附剂、展开剂、及被分离成分三者之间的关系，才能得到理想的薄层层析结果。 2.吸附剂： 对吸附剂的基本要求是颗粒细致(薄层层析用的吸附剂与其选择原则和柱层析相同。主要区别在于薄层层析要求吸附剂/支持剂的粒度更细，一般应小于250目，并要求粒度均匀)、大