赵虎：非培养方法快速检测微生物

非培养方法快速鉴定微生物非培养方法快速检验病原微生物复旦大学附属华东医院

赵 虎

2012-10-13

非培养方法快速鉴定微生物

一、病原微生物

检验的概述

（一）感染性诊断的金标准

非培养方法快速鉴定微生物¾细菌感染：分离、培养和鉴定

9明确是否有感染——诊断金标准

9明确病原菌种类——致病性强弱

9体外药敏分析 ——治疗的依据

¾其他微生物：

9病原体的抗原成分

9病原体的核酸成分

非培养方法快速鉴定微生物

¾培养鉴定时间长

¾阳性检出率低（假阴性）

9气体环境（厌氧、微需氧等）

9营养条件（苛养菌、特殊细菌等）

9渗透压（L型细菌）

9标本采集、运输和保存条件

¾假阳性率高

9污染——无菌操作不彻底

9定植——细菌寄生

非培养方法快速鉴定微生物

¾直接染色镜检

¾免疫学方法

¾分子生物学方法

¾质谱方法

¾其他快速方法

非培养方法快速鉴定微生物二、涂片染色镜检

非培养方法快速鉴定微生物¾判断标本是否合格（痰标本）

¾判断有无细菌或其他微生物存在

¾判断细菌大概的数量

¾将细菌分为革兰阳性和阴性两大类

9提供进一步鉴定的依据

9提供临床经验用药的依据

¾特殊细菌可作为初步诊断的依据

9淋病——细胞膜G-双球菌，肾形排列

9化脓性脑膜炎——G-双球菌，矛状排列

非培养方法快速鉴定微生物

抗酸染色——分枝杆菌

墨汁负染——细菌荚膜

鞭毛染色——细菌鞭毛

……

非培养方法快速鉴定微生物三、临床免疫学方法

非培养方法快速鉴定微生物

¾应用于细菌分型和鉴定

9沙门菌

9志贺菌

9霍乱弧菌

9致病大肠埃希菌

9……

非培养方法快速鉴定微生物 酶联免疫技术是将酶与抗体通过化学或物理的方法

结合起来，抗体与目标抗原反应后，连在抗体上的酶发

生一系列的酶促反应，使抗原得到很好的辨认。酶联免

疫技术的应用，太大提高了检测的敏感性和特异性，现

已广泛地应用在病原微生物的检验。优点是检测灵敏度高，速度快。

生物梅里埃公司的Vidas或mini-Vidas全自动免疫分析仪9沙门菌

9大肠埃希菌O157:H7

9单核细胞李斯特菌

9空肠弯曲菌

9葡萄球菌肠毒素

非培养方法快速鉴定微生物磁免疫技术是将抗体固定在磁珠上，

抗体与目标抗原特异反应后，通过外

加的磁场，使携带抗体抗原的磁珠富

集起来，并且与非目标菌分离，简化

了目的菌的分离和鉴定。此技术灵敏

度和特异性较强。

9产单核细胞李斯特菌

（四）其他免疫学技术

非培养方法快速鉴定微生物

¾放射免疫技术

¾荧光免疫技术

¾化学发光技术

¾生物发光技术

¾……

全血

非培养方法快速鉴定微生物

¾用于检测细胞内寄生的细菌——结核分枝杆菌（MTB）

MTB早期分泌抗原靶分子-6( ESAT-6)和培养滤液蛋白-10 ( CFP-10)是从MTB短期培养滤液中纯化分离出的低分子质量分泌性蛋白, 均由MTBRD1区基因编码, 仅存在于致病性MTB中, 如人型、牛型、非洲及某些非结核性分枝杆菌中, 而BCG 及其他非致病性分枝杆菌中则不存在。此2种蛋白以1:1的比例形成紧密复合体, 并可以这种复合体的形式发挥作用。ESAT-6和CFP-10具有较强的细胞免疫活性, 能诱导机体活化的效应T 淋巴细胞分泌IFN-γ和产生保护性免疫。

随着免疫学检测技术的不断发展, IFN-γ释放试验作为一种新型的结核病免疫学诊断工具, 通过检测外周血中特异性活化的效应T 淋巴细胞经MTB特异抗原( ESAT-6和CFP-10)刺激后分泌的IFN-γ水平, 以判断患者是否存在结核感染或活动性结核病灶。

全血

非培养方法快速鉴定微生物

¾T-SPOT-TB: ESAT-6

¾Quanti FERON-TB Gold(QFT-IT): CFP-10蛋白

9其特异性>95%, 敏感性为75%-97%

9由于ESAT-6和CFP-10蛋白只存在于MTB菌群中, 而在BCG菌株中缺乏, 该试验结果不受BCG 接种的影响。

9ESAT-6和CFP-10作为抗原, 受机体免疫状态影响较小, 因此在MTB/人类免疫缺陷病毒双重感染或免疫抑制人群、重症结核病(结核性脑膜炎等)、免疫力较低的婴幼儿和儿童中具有较高的敏感性。

非培养方法快速鉴定微生物9相对分子质量为38 000蛋白是一种磷酸盐转运蛋白, 属于MTB复合群特异性蛋白, 是通过亲和色谱法

分离的抗原。该蛋白在MTB表达量是BCG的10倍, 其含有对MTB特异性单克隆抗体定位的7个表位, 免疫原性强。该抗原介导的B淋巴细胞、T 淋巴细胞应

答对结核病诊断具有较高的特异性, 是未来建立结核病新型诊断剂的主要候选抗原。

9相对分子质量为38 000蛋白是目前研究最多的结核菌分泌抗原之一, 针对该抗原的商业化血清试剂盒也较多。ELISA法检测该蛋白在监测化疗疗效及鉴

别活动性和治疗后结核病方面具有很好的作用。

非培养方法快速鉴定微生物9Ag85复合物是MTB生长过程中分泌到胞外的主要分泌蛋白, 具有MTB种特异性和属共同抗原决定簇, 在分枝杆菌细胞壁合成的最后阶段发挥必要的作用。Ag85复合物由3种同源的蛋白质即Ag85A、Ag85B及Ag85C组成, 它们是由不同基因、不同启动子、不同转录单位表达出的功能不同的3种蛋白抗原。MTB和BCG 分泌的Ag85复合物还具有与纤连蛋白结合的特性, 这种特性使Ag85复合物可黏附于T 淋巴细胞表面, 成为细胞毒作用的靶抗原。Ag85复合物较其他胞壁蛋白或热休克蛋白(HSP)具有更强的刺激体内活化T 淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ的作用。活动性结核病患者血清Ag85复合物平均水平显著高于其他分枝杆菌疾病患者和健康对照者。