共聚焦激光显微内ppt课件
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共聚焦激光荧光显微镜简介以及原理ppt课件
;
• 〔2〕多光束扫描
;
• 奥林巴斯Fluo View300 激光共聚焦扫描系统
强度调整密度塔
激发发 射和射 柱准直 仪
光电倍增器
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ电源
双色镜
X-Y检流计镜扫描 控制器
激发和 发射滤 波滑动 器
出入口透 镜系统
;
同样可以实现 X—Z轴,Y—Z轴扫描
;
• 通常的方法是经过计算机控制的马达以预 先设定的步距挪动显微镜的镜台然后采集 图像。
配置照明效率低,而且扫描速度更快。其中旋 转盘扫描仪有数百个孔,其功能作为照明和探 测的针孔。由于磁盘扫描显微镜构成的实像, 可以直接位于CCD照相机的图像平面中。虽然 这方面的优势,它允许实时聚焦和成像的动态 过程,有几个缺陷限制了磁盘扫描共聚焦系统 的实践成效。其中最严重的是典型的依赖于传 统的广谱光源,和在磁盘发生极端的光损失。
共聚焦激光扫描荧光显微镜 〔LaserscanningConfocalMicrosco py,LSCM 〕
以激光作为光源,采用光源针孔 共与聚检焦系测统针孔共轭聚焦技术,对样本进 展细断胞层CT 扫描,以获得高分辨率光学切 片的荧光显微镜系统
;
荧光和荧光显微镜
一、荧光的根底术语 荧光物质:
488nm 520nm
双色镜:双色分光镜;反射短波长,透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜:多为长通滤色镜;LP490
;
450nm
490nm
FITC
荧光显微镜的缺乏:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实 现多重荧光的同时采集及共定位。
2.荧光散射光太强,呵斥实践分辨率的大大下 降。
3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进展断层扫描,完成3D的任务。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度
• 〔2〕多光束扫描
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• 奥林巴斯Fluo View300 激光共聚焦扫描系统
强度调整密度塔
激发发 射和射 柱准直 仪
光电倍增器
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ电源
双色镜
X-Y检流计镜扫描 控制器
激发和 发射滤 波滑动 器
出入口透 镜系统
;
同样可以实现 X—Z轴,Y—Z轴扫描
;
• 通常的方法是经过计算机控制的马达以预 先设定的步距挪动显微镜的镜台然后采集 图像。
配置照明效率低,而且扫描速度更快。其中旋 转盘扫描仪有数百个孔,其功能作为照明和探 测的针孔。由于磁盘扫描显微镜构成的实像, 可以直接位于CCD照相机的图像平面中。虽然 这方面的优势,它允许实时聚焦和成像的动态 过程,有几个缺陷限制了磁盘扫描共聚焦系统 的实践成效。其中最严重的是典型的依赖于传 统的广谱光源,和在磁盘发生极端的光损失。
共聚焦激光扫描荧光显微镜 〔LaserscanningConfocalMicrosco py,LSCM 〕
以激光作为光源,采用光源针孔 共与聚检焦系测统针孔共轭聚焦技术,对样本进 展细断胞层CT 扫描,以获得高分辨率光学切 片的荧光显微镜系统
;
荧光和荧光显微镜
一、荧光的根底术语 荧光物质:
488nm 520nm
双色镜:双色分光镜;反射短波长,透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜:多为长通滤色镜;LP490
;
450nm
490nm
FITC
荧光显微镜的缺乏:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实 现多重荧光的同时采集及共定位。
2.荧光散射光太强,呵斥实践分辨率的大大下 降。
3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进展断层扫描,完成3D的任务。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度
共聚焦显微镜应用PPT课件
共聚焦显微镜应用
——细胞原位检测核酸
目录
▪ 概述 ▪ PI的特性 ▪ PI的应用 ▪ PI标记细胞的方法
概述
激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特征 及含量,即实现定位、定性及定量检测核酸。该方法常用于细胞核 定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色 体定位观察等。
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
演讲人:XXXXXX 时 间:XX年XX月XX日
PI标记细胞的方法
▪ 样品为活细胞
▪ 可直接向细胞外液中加人PI,使终浓度为1~15 μg/ml(根据细胞 种类及其密度而异),室温放置5~15min后,用激光扫描共聚焦 显微镜检测。
▪ 细胞膜完好的正常活细胞,PI不能染色;
▪ 膜不完整的细胞及死细胞则可检测到PI的红色荧光,此时观察到 的是细胞内DNA和RNA的总量。该项检测最好在短时间内完成,
Hale Waihona Puke PI应用▪ PI标记可以是活细胞也可以是固定的细胞
▪ 当标记活细胞样品时,目的在于检查细胞的膜完整性及其坏死情 况,常应用于检测膜损伤、细胞凋亡;
▪ 标记固定细胞时,目的一般是进行细胞核定位、显示细胞核或染 色体的形态、定量测定核酸等,常应用于检测细胞周期、细胞凋 亡、RNA和DNA在细胞内的分布及其含量变化、以及用作核酸显 色剂
谢谢聆听
未完待续
楚河汉界
小鼠肠道及其中的人类肠道 微生物,63x
重影的林
小鼠耳部血管与神经网, 10x
无定形
拟南芥的幼芽,40x
结束语
当你尽了自己的最大努力时,失败也是伟大的, 所以不要放弃,坚持就是正确的。
——细胞原位检测核酸
目录
▪ 概述 ▪ PI的特性 ▪ PI的应用 ▪ PI标记细胞的方法
概述
激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特征 及含量,即实现定位、定性及定量检测核酸。该方法常用于细胞核 定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色 体定位观察等。
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
演讲人:XXXXXX 时 间:XX年XX月XX日
PI标记细胞的方法
▪ 样品为活细胞
▪ 可直接向细胞外液中加人PI,使终浓度为1~15 μg/ml(根据细胞 种类及其密度而异),室温放置5~15min后,用激光扫描共聚焦 显微镜检测。
▪ 细胞膜完好的正常活细胞,PI不能染色;
▪ 膜不完整的细胞及死细胞则可检测到PI的红色荧光,此时观察到 的是细胞内DNA和RNA的总量。该项检测最好在短时间内完成,
Hale Waihona Puke PI应用▪ PI标记可以是活细胞也可以是固定的细胞
▪ 当标记活细胞样品时,目的在于检查细胞的膜完整性及其坏死情 况,常应用于检测膜损伤、细胞凋亡;
▪ 标记固定细胞时,目的一般是进行细胞核定位、显示细胞核或染 色体的形态、定量测定核酸等,常应用于检测细胞周期、细胞凋 亡、RNA和DNA在细胞内的分布及其含量变化、以及用作核酸显 色剂
谢谢聆听
未完待续
楚河汉界
小鼠肠道及其中的人类肠道 微生物,63x
重影的林
小鼠耳部血管与神经网, 10x
无定形
拟南芥的幼芽,40x
结束语
当你尽了自己的最大努力时,失败也是伟大的, 所以不要放弃,坚持就是正确的。
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件
Pathway415、 Pathway435 800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra(Vnieikwo™n)C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
精选课件PPT
精选课件PPT
35
荧光光谱
精选课件PPT
36
精选课件PPT
37
分隔发射的荧光
精选课件PPT
38
Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
精选课件PPT
39
(四)计算机系统
控制硬件的软件功能:
①控制电动显微镜; ②选择激光波长,调节激光强度; ③拍摄2-5维图像; ④选择光谱拍摄范围,分辨率,激发光 挡片位置。
(10)、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting,感兴趣区域) 实时(real time)显示
(11)、有线和帧方式的多重扫描功能
精选课件PPT
27
(12)、在改变扫描分辨率及扫描速度等后,无 须很复杂地对仪器参数重新设置
(13)、有记忆功能
(14)、有专用的图象数据库 (15)、系统采用模块化设计,便于整个系统 的扩展和升级换代
有多种方式选择,支持盲法拆分,方便用户使用;
⑾具有专业的FRAP(荧光漂白),FRET(荧光能
量共振转移)软件包。 精选课件PPT
41
精选课件PPT
42
三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
(一)样品制备
激光共聚焦(简化版)课件
和观察。
技术挑战与解决方案
荧光漂白问题
采用低能量激光束进行扫描,降低对样本的损伤,同时采用快速 恢复的荧光蛋白或染料。
光学切片厚度问题
采用光学切片技术,减少切片厚度,提高成像分辨率。
荧光穿透深度问题
采用多波长激光激发和光谱成像技术,提高荧光穿透深度。
未来发展趋势
更高分辨率和更深的成像
利用超分辨技术和光片显微成像技术,实现更高分辨率和更深层次的成像。
曝光时间
根据荧光强度和显微镜性 能,调整曝光时间以确保 图像的动态范围和细节。
图像处理
色彩校正
伪彩色
对图像进行色彩校正,确保颜色准确 性和对比度。
将灰度图像转换为彩色图像,增强视 觉效果和目标识别。
背景消除
去除图像中的背景噪声,提高目标结 构的可见度。
定量分析
细胞识别
利用图像处理算法自动识别细胞 和其他组织结构。
激光共聚焦(简化版)课 件
目录
Contents
• 激光共聚焦技术简介 • 激光共聚焦显微镜 • 图像处理与分析 • 实验技术与应用 • 激光共聚焦技术前沿与展望
01 激光共聚焦技术简介
定义与特点
定义
激光共聚焦技术是一种光学显微 技术,利用激光作为光源,通过 共聚焦显微镜观察和解析细胞或 组织的结构和功能。
定量测量
对识别出的细胞或组织结构进行定 量测量,如面积、周长、形状因子 等。
统计分析
对测量结果进行统计分析,比较不 同样本或条件下的差异。
04 实验技术与应用
样本制备
样本选择
选择适合观察的样本,如细胞、 组织切片或活体样本。
固定与透明化
对样本进行固定和透明化处理, 以便于观察。
共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色PPT课件
左右
➢标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本
下部,而物镜直接观察到的上部不能充分激发
➢尽量去除非特异性荧光信号
➢封片剂多用甘油:PBS混合液(9:1)
第16页/共23页
激光共聚焦适用的器皿及要
求
第17页/共23页
一、活细胞直接免疫荧光染色(溶酶体或钙离子)
(1)将A549细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦
培养皿中间的圆形凹槽里;
(2)染色前吸除培养皿的培养液,用PBS洗2-3
次;
(3)向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或
Fluo-4/AM工作液200μL,使其覆盖凹槽里
全部细胞;
(4)37 ℃、5%CO2 培养箱中孵育30 min;
(5)吸除染液,用PBS洗2-3次;
(6)再用800μL的PBS覆盖凹槽里全部细胞,
德国Leica激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介
第1页/共23页
基本参数
➢型号:德国Leica SP5 II
➢激光器:4个 发射波长400nm-800nm
➢物镜:10倍
➢通道:多通道
20倍
63倍
多色
➢系统:windows 7+LAS AF
➢活体细胞装置:配有
第2页/共23页
激光扫描共聚焦显微镜 的基本特点
37℃孵育60 min(避光)。
(5)染核并封片
用PBS(5min×3)冲洗后,滴加
DAPI染
核5min, PBS冲洗(5min×3),滴加
抗荧
光淬灭封片液。
(6)激光共聚焦显微镜拍照
第20页/共23页
Leica网上课程
Leica Science Lab网址:
➢标本不能太厚,如太厚激发光大部分消耗在标本
下部,而物镜直接观察到的上部不能充分激发
➢尽量去除非特异性荧光信号
➢封片剂多用甘油:PBS混合液(9:1)
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激光共聚焦适用的器皿及要
求
第17页/共23页
一、活细胞直接免疫荧光染色(溶酶体或钙离子)
(1)将A549细胞细胞培养于35 mm 激光共聚焦
培养皿中间的圆形凹槽里;
(2)染色前吸除培养皿的培养液,用PBS洗2-3
次;
(3)向培养皿中轻轻滴入Lyso-Tracker Red或
Fluo-4/AM工作液200μL,使其覆盖凹槽里
全部细胞;
(4)37 ℃、5%CO2 培养箱中孵育30 min;
(5)吸除染液,用PBS洗2-3次;
(6)再用800μL的PBS覆盖凹槽里全部细胞,
德国Leica激光扫描共聚焦显微镜SP5 II简介
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基本参数
➢型号:德国Leica SP5 II
➢激光器:4个 发射波长400nm-800nm
➢物镜:10倍
➢通道:多通道
20倍
63倍
多色
➢系统:windows 7+LAS AF
➢活体细胞装置:配有
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激光扫描共聚焦显微镜 的基本特点
37℃孵育60 min(避光)。
(5)染核并封片
用PBS(5min×3)冲洗后,滴加
DAPI染
核5min, PBS冲洗(5min×3),滴加
抗荧
光淬灭封片液。
(6)激光共聚焦显微镜拍照
第20页/共23页
Leica网上课程
Leica Science Lab网址:
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
18Biblioteka THANK YOU19
7
只要载物台沿着Z轴上下移动,将样品新的一个层面移动 到共焦平面上,样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率:0.18μm
点照明,具有照明点和探测点,具有扫描系统,逐点扫描 成像
具有四个荧光通道,可同时探测多个被标记物,一个透射 光道,同时采集透射光图像(非共焦图像)
8 8
弧灯 膜
目镜
孔
9
02 应用
10
11
12
Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
Pyr
12
13
黑麦草
洋葱
13
北京化工 大学
14
15
15
16
16
A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres
17
(a) Preparation process for HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres. (b,c) CLSM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm). (d,e) SEM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm; scale bar 100 nm).
4
荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发,产生不同颜色的荧光,以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光:组织,细胞不经荧光色素染色,在紫外光照射下,某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光:组织,细胞经荧光色素染色,由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
共聚焦激光扫描显微术ppt课件
放
四.细胞内PH值的测定,脑缺血,损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布,密度,调控因素,网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术,套除细胞器,移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子,使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理:紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理: 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物:
邻硝基甲 苯衍生物:
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓,否则容易造成观者的阅读压 力,适得其反。正如我们都希望 改变世界,希望给别人带去光明,
但更多时候我们只需要播下一颗
种子,自然有微风吹拂,雨露滋
养。恰如其分地表达观点,往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二.神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三.细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化,受体激活,电刺激与钙的释
0.00
四.细胞内PH值的测定,脑缺血,损伤时细 胞内PH变化
荧光漂白恢复技术(FRAP)与细胞间通讯研究
Gap junction的分布,密度,调控因素,网络阻断剂(Othanol , Dieldrin)
6. 激光手术切除神经细胞突起 光陷阱技术,套除细胞器,移动染色体
7. 神经细胞编程性死亡(programmed cell death,PCD) 与细胞内钙的关系
通过基团修饰以掩蔽生物活性分子,使其以惰性前体形式 存在。通常是可逆的。
原理:紫外线照射→共价键断裂→释放生物活性分子
PART ONE
锁化合物的两种光化学反应原理: 氮苯的光致同分异构作用和硝基甲苯的光 分解作用
#2022
偶氮苯衍生物:
邻硝基甲 苯衍生物:
01.
目前应用最广泛的笼锁化合物系利用硝基甲苯 的光敏性质合成。
髓,否则容易造成观者的阅读压 力,适得其反。正如我们都希望 改变世界,希望给别人带去光明,
但更多时候我们只需要播下一颗
种子,自然有微风吹拂,雨露滋
养。恰如其分地表达观点,往往
事半功倍。
二、基本原理
1.光学成像
激光器产生的激光经物镜聚焦到 样品上
反射光或荧光经目镜汇聚于探测 器
探检测器前有一小孔(Pinhole) 汇聚光束
五、在神经 生物学的应 用
1.神经细胞参数测定及三维重建
细胞外形 浦肯野氏细胞及其突起的投射 神经细胞轴突走向及神经支配的研究 神经骨架重组的研究
二.神经递质、调质及细胞内活性物质受体 的荧光定位
三.细胞内钙离子的测定
○ 细胞内信号传导的研究 ○ 钙内流与神经递质释放的关系 ○ 微环境变化,受体激活,电刺激与钙的释
0.00
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高,不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能,对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感,因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高,需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描,可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高,该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高,可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ,有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件,以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前,需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数,如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理,以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面,方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型,包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件,用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ,包括图像预处理、特征提取、
《激光共聚焦技术》课件
多模态成像技术结合
将激光共聚焦技术与其它成像技术(如超声、MRI等)相 结合,可以实现多模态、多尺度的成像,为科学研究提供 更多信息。
人工智能与大数据分析
结合人工智能和大数据分析技术,对激光共聚焦图像进行 深度挖掘和定量分析,提高实验结果的可靠性和可重复性 。
05
实验操作与注意事项
实验前的准备
实验材料
将激光束转换为扫描线,并控 制显微镜的X和Y轴移动。
检测器
用于检测荧光信号,并将信号 转换为电信号。
激光器
用于产生激发光,常用波长为 405nm、488nm、561nm和 640nm。
物镜
用于将激光束聚焦到样品上, 并收集荧光信号。
计算机
用于控制扫描头、物镜和检测 器,并收集和处理荧光信号。
性能指标
光漂白与光毒性
强激光束可能会引起荧光分子的光漂 白和光毒性,影响实验结果和细胞活 性。
未来发展与展望
提高成像速度
未来可以通过改进扫描技术和提高探测器性能来提高激光 共聚焦技术的成像速度,以适应更多动态观察的需求。
拓展应用领域
随着技术的进步和应用需求的增加,激光共聚焦技术有望 在更多领域得到应用,如医学诊断、药物研发等。
细胞生物学研究
细胞形态与结构研究
利用激光共聚焦技术观察细胞形态、细胞器结构以及细胞骨架等,有助于深入 了解细胞生物学特性。
细胞分子定位与相互作用
通过荧光标记技术,对特定分子进行定位和追踪,研究分子在细胞内的分布、 动态变化以及与其他分子的相互作用。
医学诊断与治疗
疾病诊断
利用激光共聚焦技术对活体组织进行无创检测,有助于早期发现和诊断肿瘤、炎 症等疾病。
显微镜设置
根据实验需求,设置 激光波长、扫描速度 、分辨率等参数。
激光共聚焦技术PPT课件
科学、药理学和遗传学等领域中新的
有力研究工具。
.
3
激光共聚焦显微镜在生物学中的应用
原位鉴定细胞或组织内生 活体细胞或组织功能的实
物大分子、观察细胞及亚 时动态监测
细胞形态结构
实时定量测定细胞内Ca2+变
检测核酸
化
检测蛋白质细胞定位
测定细胞内pH变化
检测细胞凋亡
检测膜电位变化
细胞器的观察及测定 检测细胞融合 观察细胞骨架 检测细胞间缝隙连接通讯 检测细胞内脂肪
另外Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其 它形式的钙也有作用。
.
15
Projection
save “projection”
.
16
图7~10. 7. 连续降温下生成 Ca2 + 荧光随时间变化的曲线 同时记录的荧光图像, 显示冬 小麦胞内荧光有相同的变化趋 势。8. 连续降温下生成Ca2 + 荧光随时间变化的曲线同时记 录的荧光图像, 显示春小麦胞 内荧光有相同的变化趋势。9. Fluo-3/ AM染色后,静息态下冬 小麦原生质体的三维重组图像。 10. Fluo-3/ AM染色后,静息态 下春小麦原生质体的三维重组 图像。
图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定 酶切:重组质粒酶切产物;M:Marker DL 2000;PCR:重组质粒PCR产物
.
21
目的蛋白细胞器定位观察
含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞
(1)将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20 μL分别 (2)加入1.5 mL离心管中,分别加入500 μL的蒸馏水,两管分别标号P1,P2。 (2) 分别取4片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入P1,P2。 (3)将P1,P2管管盖打开,用封口膜将其封上,扎两到三个小孔。 (4)将P1,P2管进行抽真空,抽到刚刚沸腾为止,一共抽三次。 (5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。 (6)取出P1,P2管中的洋葱表皮,将其铺在MS培养基的滤纸上,加少量的水 培养16小时。
激光共聚焦简化版ppt课件
序列扫描的方法排除荧光串色
如图所示是使用序列扫描的方法排除荧光串色的例子: 使用 DAPI (蓝色)来标记细胞核、Cy2 (绿色)来标记 Na+/K+ ATPase、Alexa 568 phallodin (红色)来标记 F-actin。 未使用序列扫描的时,DAPI 的信号串到了 Cy2 通道,Cy2 的信号又串到了 Alexa 569 通道。 同一个标本使用序列扫描后,所有的颜色都被清楚的分开,排除了荧光串色的影响。
紫外 蓝 绿
高压汞灯
被荧光探针染色的生物样本
激发
被标记结构的荧光光学图像
光学 成像
滤镜 分光
488nm 520nm
FITC
450nm 490nm
普通荧光显微镜是广视场显微镜
普通荧光显微镜是广视场显微镜
荧光相互干扰--图象清晰度降低
激发的特异性差--背景荧光高
显微镜+
各种染色 标记技术
荧光标记技术
优点:1.灵敏度高,比常规免疫组织化学的灵 敏度高1000倍。 2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观 察多种物质的共定位。 3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态 变化
荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象:当使用多种荧光染料标记标本时,或当标本具有很强的自发荧光时,很容易产生串色现象。
最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作对照: 首先观察第一种荧光染料单标记的标本,使用第一种荧光染料的激发光,在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色;然后观察第二种荧光染料单标记的另一个标本,使用第二种荧光染料的激发光,在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。 如果发现有荧光串色,则根据不同情况,使用序列扫描或光谱扫描的方法来排除串色的影响。
如图所示是使用序列扫描的方法排除荧光串色的例子: 使用 DAPI (蓝色)来标记细胞核、Cy2 (绿色)来标记 Na+/K+ ATPase、Alexa 568 phallodin (红色)来标记 F-actin。 未使用序列扫描的时,DAPI 的信号串到了 Cy2 通道,Cy2 的信号又串到了 Alexa 569 通道。 同一个标本使用序列扫描后,所有的颜色都被清楚的分开,排除了荧光串色的影响。
紫外 蓝 绿
高压汞灯
被荧光探针染色的生物样本
激发
被标记结构的荧光光学图像
光学 成像
滤镜 分光
488nm 520nm
FITC
450nm 490nm
普通荧光显微镜是广视场显微镜
普通荧光显微镜是广视场显微镜
荧光相互干扰--图象清晰度降低
激发的特异性差--背景荧光高
显微镜+
各种染色 标记技术
荧光标记技术
优点:1.灵敏度高,比常规免疫组织化学的灵 敏度高1000倍。 2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观 察多种物质的共定位。 3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态 变化
荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射光谱互相重迭的现象:当使用多种荧光染料标记标本时,或当标本具有很强的自发荧光时,很容易产生串色现象。
最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作对照: 首先观察第一种荧光染料单标记的标本,使用第一种荧光染料的激发光,在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色;然后观察第二种荧光染料单标记的另一个标本,使用第二种荧光染料的激发光,在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。 如果发现有荧光串色,则根据不同情况,使用序列扫描或光谱扫描的方法来排除串色的影响。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
细胞膜流动性研究
总结词
详细描述
利用荧光染料标记细胞膜,在激光扫 描共聚焦显微镜下观察标记物的动态 变化,通过分析荧光强度和分布的变 化,可以了解细胞膜的流动性。
神经元突起研究
总结词 详细描述
细胞骨架结构研究
总结词
详细描述
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜的未 来发展与挑战
技术创新与改进
分辨率提升 高速成像 多维成像
应用领域的拓展
临床诊断
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 临床诊断,通过观察活体组织样 本,为疾病诊断和治疗提供更准
确的依据。
药物研发
利用激光扫描共聚焦显微镜观察 药物对细胞的作用和影响,为新
药研发提供实验支持。
生物科学研究
将激光扫描共聚焦显微镜应用于 生物科学研究,探索细胞和分子
层面的生命活动规律。
实验伦理与法规
动物实验伦理 数据处理与隐私保护 法规遵循
WATCHING
激光扫描共聚焦显微 镜教学课件
• 激光扫描共聚焦显微镜简介 • 激光扫描共聚焦显微镜操作流程 • 激光扫描共聚焦显微镜实验技术 • 激光扫描共聚焦显微镜实验案例 • 激光扫描共聚焦显微镜的未来发展与挑战
CHAPTER
激光扫描共聚焦显微镜简介
定义与特点
定义 特点
工作原理
01
激光束通过显微物镜照 射到样品上,形成光斑;
01
样品选择
02 样品预处理
03 载玻片准备
显微镜设置
光源选择
物镜选择
滤色片配置 扫描速度与分辨率设置
图像采集
校准
。
采集参数设置
多区域采集 实时预览
数据分析
图像处理
共聚焦激光显微内ppt课件
7
研究方法:
• 筛选符合该实验的患者,排除不符合检查 标准,签署患者知情同意书,普通肠镜检 查,共聚焦激光显微内镜检查,窄带成像 技术检查,取活检送病理 。
8
CLE诊断管状腺瘤的参考标准
• 隐窝圆形或卵圆形,隐窝腔大小不一,部 分呈囊性扩张。 • 可见到复层上皮,伴有杯状细胞减少,无 细胞异型性。 • 间质血管增粗,炎性细胞浸润。
CP为微血管形态
12
NBI诊断标准-2
• (1)正常结构:pit周围微血管形态呈蜂窝样行走,多见于 正常黏膜; • (2)不清楚结构:难以清楚地观察微血管形态,多见于增生 性病变; • (3)网状结构:呈粗大椭圆形微血管,多见于管状腺瘤; • (4)密集结构:微血管粗大而密集,被覆上皮充血明显,多 见于绒毛状腺瘤或管状绒毛状腺瘤或侧向发育型肿瘤 (LST); • (5)不规则结构:呈粗大蛇形微血管,多见于高级别瘤变和 癌; • (6)稀疏结构,微血管分布明显减少,多见于癌。
共聚焦激光显微内镜与窄带成像技术对共聚焦激光显微内镜与窄带成像技术对大肠腺瘤性息肉诊断价值的对比研究大肠腺瘤性息肉诊断价值的对比研究共聚焦激光显微内镜与窄带成像技术对大肠腺瘤性息肉诊断价值的对比研究大肠腺瘤样息肉是大肠癌的癌前病变腺瘤一癌序贯学说已被大多数人所接受和认可早期诊断腺瘤样息肉对于大肠癌的防治意义重大发现并切除大肠腺瘤可有效地预防大肠癌的发生
4
目前国内外对该课题的研究简况:
• 目前国内对于大肠腺瘤性息肉的诊断方法 主要是:X线钡餐造影或气钡双重造影、内 镜检查,应用共聚焦激光显微内镜在大肠 腺瘤性息肉的研究资料较少。
5
研究内容:
• 比较共聚焦激光显微内镜与窄带成像技术 与对大肠腺瘤性息肉的诊断价值。
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9
CLE诊断绒毛状腺瘤的标准
• 隐窝腔狭长、窄小、弯曲毛状,可见到复 层上皮,伴有杯状细胞减少,细胞核增大 增粗,炎性细胞浸润。
10
CLE诊断绒毛管状腺瘤的标准
• 兼有管状腺瘤及绒毛状腺瘤的特点。
11
NBI诊断标准-1
• (1)CP—I型:腺管周围呈规则的六角型蜂窝样微血管(直径 8.6±1.8~12.4±1.9 um),多见于正常黏膜和增生 性息肉; • (2)CP一11型:微血管直径粗于正常,腺管周围呈管状和 卵圆状微血管(直径13.1±3.3um),部分蜂窝样微血管 残存,多见于腺瘤性息肉; • (3)CP—III型:腺管周围不规则微血管粗细不等、走向中 断和密度增加(直径18.3±0.1~19.8±7.6um),蜂 窝样微血管被破坏,多见于癌性肿瘤。
7
研究方法:
• 筛选符合该实验的患者,排除不符合检查 标准,签署患者知情同意书,普通肠镜检 查,共聚焦激光显微内镜检查,窄带成像 技术检查,取活检送病理 。
8
CLE诊断管状腺瘤的参考标准
• 隐窝圆形或卵圆形,隐窝腔大小不一,部 分呈囊性扩张。 • 可见到复层上皮,伴有杯状细胞减少,无 细胞异型性。 • 间质血管增粗,炎性细胞浸润。
4
目前国内外对该课题的研究简况:
• 目前国内对于大肠腺瘤性息肉的诊断方法 主要是:X线钡餐造影或气钡双重造影、内 镜检查,应用共聚焦激光显微内镜在大肠 腺瘤性息肉的研究资料较少。
5
研究内容:
• 比较共聚焦激光显微内镜与窄带成像技术 与对大肠腺瘤性息肉的诊断价值。
6
研究条件:
• 吉林大学内镜中心为省级内镜培训基地及 质控中心;具备共聚焦激光显微内镜(CLE) 及窄带成像技术(NBI)内镜及所需其他设 施,因此,完全可以开展共聚焦激光显微 内镜与窄带成像技术与对大肠腺瘤性息肉 的检查及诊断。
共聚焦激光显微内镜与窄带成像技术对 大肠腺瘤性息肉诊断价值的对比研究
1
研究课题名称:
• 共聚焦激光显微内镜与窄带成像技术对大 肠腺瘤性息肉诊断价值的对比研究
2
研究目的、意义(理论或实际意义):
• 大肠腺瘤样息肉是大肠癌的癌前病变,腺瘤一癌 序贯学说已被大多数人所接受和认可,早期诊断 腺瘤样息肉对于大肠癌的防治意义重大,发现并 切除大肠腺瘤可有效地预防大肠癌的发生。
CP为微血管形态
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NBI诊断标准-2
• (1)正常结构:pit周围微血管形态呈蜂窝样行走,多见于 正常黏膜; • (2)不清楚结构:难以清楚地观察微血管形态,多见于增生 性病变; • (3)网状结构:呈粗大椭圆形微血管,多见于管状腺瘤; • (4)密集结构:微血管粗大而密集,被覆上皮充血明显,多 见于绒毛状腺瘤或管状绒毛状腺瘤或侧向发育型肿瘤 (LST); • (5)不规则结构:呈粗大蛇形微血管,多见于高级别瘤变和 癌; • (6)稀疏结构,微血管分布明显减少,多见于癌。
• CLE对于管状腺瘤的诊断优势在于,它借助激光 共聚焦成像的方式,显示大肠粘膜层的组织学结 构,从而为管状腺瘤的镜下组织学诊断提供可能。
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研究目的、意义(理论或实际意义):
• 大肠息肉在临床上可以分为非肿瘤性息肉、肿瘤 性息肉和息肉综合征。 • 其中肿瘤性息肉也称之为腺瘤样息肉 (adenomatouspoly),由于其恶变几率相对较高, 成为多年来的研究热点。 • 腺瘤样息肉的组织学分型包括:管状腺瘤、绒毛状 腺瘤和管状绒毛状腺瘤三个类型。 • 其分型一般依据绒毛状成分的多少来划分:绒毛成 分占20%以下为管状腺瘤,20%一80%为管状绒 毛状腺瘤,80%以上为绒毛状腺瘤。
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Pit为腺管开口
研究进度及具体安排:
• 2011年6月至2012年6月收集门诊及病房大 肠息肉患者。 • 2011年6月至2012年6月对患者行共聚焦激 光显微内镜及NBI检查并记录数据。 • 2012年7月至2012年末进行数据整理、比 结果比较,共聚焦激光显微内镜对 于诊断大肠腺瘤性息肉较NBI技术有优势
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