水溶性化合物的研提取分离

1 阳离子交换树脂 2．阴离子交换树脂
主要用于分离 氨基酸，生物碱，糖类化合物

2.3 分配柱色谱
将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶、硅藻土或纤维素粉等载 体上作为固定相，再用与固定相不相混溶的另一相溶剂作为流 动相，这样，物质可在两相溶剂相对做逆流移动过程中不断进 行动态分配而得以分离。 1 正相层析： 固定相采用强极性溶剂，如水、缓冲溶液等 ，流动相则用氯仿、乙酸乙酯等弱极性溶剂，称之为正相层析。 2 反相层析： 以弱极性成分如石蜡油为固定相，流动相则 以水、乙腈、甲醇强极性溶剂，则两相颠倒，称之为反相 (reverse phase，RP)层析，更适合于水溶性成分的分离。
常见的有TSKgelToyopead HW40F、HW40C、HW65等，这类层析担体的缺陷是 对非芳香化合物的分离作用局限于分子筛的作用，对等分子量的化合物分离 显得无能为力。 TSKgelPhenyl-Toyopead， TSKgelButyl-Toyopead 650是该系列的改进型， 通过在HW65上引入苯基和丁基而形成的，吸附力超过ODS，但引入的苯基和 丁基可能会被较低极性洗脱剂洗下，污染分离物，限制了它们的实际使用。
3各种色谱材料在水溶性成分分离中的应用

无论是反相的MCIgelCHP 20P系列，还是以分子大小来分的 Sephadex LH-20系列、TSKgelToyopead系列，以及兼有反相吸附和 反相分配功能的ODS系列担体，在植物水溶性成份的分离研究 中显示出了它们的能力。

但是至今为止利用反相层析担体进行植物水溶性成份的研完工 作还是探索性的，对于不同反相层析担体的性能以及不同化合 物在不同层析担体上的层析行为还没有完全了解，这样就限制 了它们的应用。
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3.2 TSKgelToyopead 系列

针对Sephadex LH20的缺陷而生的一类层析担体。

它是一种多孔性的含亲水性羟基的聚乙烯高聚物，耐酸碱和霉菌，颗粒细， 硬度大，纵向扩散小，出峰集中，在层析行为上类同Sephadex LH20 ，对芳 香化合物具有一定的吸附作用，而对非芳香化合物则以分子大小来分离。

3.1 Sephadex系列层析担体


常见的SephadexG因交联度的不同可分为G10，G15，G25……G100，G200等。 对水溶性化合物常用的是Sephadex LH-20，由SephadexG-25转化而来， 即在葡聚糖的羟基上引入了一个羟丙基，使得它的极性反转成为疏水性。

对于芳香化合物，尤其是含酚羟基的化合物有着一定的吸附作用，而对 非芳香化合物则根据分子大小的不同来进行分离。


4.1葡萄籽原花青素的提取

葡萄籽粉碎，过20目，用70％丙酮，料液比1∶7，室温提取12 小时，共提取三次。 提取液合并后，40º C真空浓缩，蒸去丙酮后加入一定量水，静 置12h后过滤除去沉淀，得到澄清的粗提物。 粗提物水溶液过AB-8树脂吸附后，先用水洗去部分糖、蛋白等 组分，再用30%乙醇洗脱大部分原花青素，收集30%乙醇洗脱 液，经真空浓缩、干燥。 将上步提取物经乙酸乙酯抽提得葡萄籽原花青素提取物（标为 PC组分，其中原花青素干基含量＞95％）。

从植物中分离得到的单体即使具有很强的活性，如结构不清楚，则无法 进行药效学和毒理学研究，也不可能进行人工合成或结构修饰、改造工作， 更谈不上进一步的开发，将会失去应用价值。

色谱分离技术为天然产物的分离、分析提供重要手段。
2 色谱技术的分类

色谱法又称层析法，是用于分离有机混合物的一种高效分离技术。 1906年，俄国植物学家茨维特（Tsvet）首创了这种分离技术，他把植物叶 绿素的石油醚浸渍液倒入一根装有碳酸钙吸附剂的细直玻璃柱中，再加入 纯石油醚，任其自由流下，原混合物开始被分离成不同颜色的谱带，且以 不同速度通过柱子，然后按谱带颜色对混合物进行鉴定分析。把这种分离 结果称为色谱图，把这种分离方法命名为色谱法。 多年来，色谱理论逐步建立和发展，从分离手段发展到分析手段，色谱方 法的应用范围不断扩大，色谱分离的对象早已不限于有色物质，已逐步实 现仪器化、自动化、高速化，但“色谱法”这一名称一直被沿用。
2.4 凝胶色谱
凝胶色谱也叫凝胶渗透 或分子筛过滤。 固定相是用具有一定大小孔径的多孔凝胶制成的。各组分 在柱内的保留时间和从柱中流出的次序决定于分子的大小，分 子量大的体积大，不能进入凝胶颗粒内部而被排阻在凝胶粒子
外部，只能在颗粒间隙移动，较早地被溶剂冲洗出来，因此大 分子首先从柱底流出：分子量小的体积小，可自由渗入微孔并 扩散到凝胶颗粒内部，故通过色谱柱时阻力增大、流速变慢， 最后从柱底流出，因此，各组分在凝胶柱色谱中被洗脱出柱的 先后顺序基本上是按分子大小排列的，即按分子由大到小流出， 从而得到分离。

2.5 亲和柱色谱
利用某些生物学和生物化学过程中特异性相互作用的性质， 如抗体和抗原被此特异地结合。这种特异性的相互作用产生高 选择性反应，这种高选择性又是可逆的，如果一对物质中的一 种以共价键的方式键合在一种适当的载体(如琼脂糖)上，又不 丧失其功能的话，那么这种固相化的制剂，就可以从溶液中选 择性结合该对物质中的另一种物质，结果只将所需要的组分结 合到制剂上，其他物质可以用洗脱的方法排除掉，再用适当方 法使所需要的物质分离并释出。 主要用于生物活性物质如：(蛋白质、核酸、核苷酸、肽、酶等) 的分离



3.4 MCIgelCHP 20P系列
MCIgelCHP 20P是一种多孔性的聚苯乙烯高聚物。

它所显示的反相吸附作用较为广泛，除了对高极性的糖、氨 基酸基本没有吸附作用外，对大多数次生代谢产物均有不同程 度的吸附作用

它一方而能有效地去除对水溶性成分分离干扰极大的糖 ，氨 基酸等杂质， 另一方面可以将不同类的化合物分离开。
3各种色谱材料在水溶性成分分离中的应用
传统的植化研究方法，如酸碱热处理、硅胶柱层析， 1.易产生衍生物， 2.分离、精制过程中样品损失大，很难如实地反映植物的化学成分，在水溶 性成分的研究中尤为突出。

由于水溶性成分往往有着比脂溶性成分更为复杂的结构，如，较长的糖 链和敏感的官能团-酚羟基，对酸碱热更不稳定，且硅胶对水溶性成分的强 吸附作用使得分离变得更加困难。
它的洗脱条件也是不尽相同，既可以是极性由大到小的反相系统，也可 以为如硅胶层析一样的正相系统，在实际分离过程中可视所分离化合物的性 质再定。 Sephadex LH20 的缺陷是耐弱碱但不耐酸，易长霉，吸水膨胀使得强度 不够，因此不适合于加压柱，颗粒也显得偏大，另外纵向扩散使得出峰不太 集中也是它的不足之处。

2 大孔吸附树脂

常用的为苯乙烯型和丙烯腈型。根据被分离化合物的分子体积的大小选用 的树脂的适当孔径；其次，要根据分子中是否含有羟基、羧基或碱性氮原 于来确定树脂的型号和分离条件。
2.2 离子交换柱色谱

以离子交换树脂或表面涂有液体离子交换树脂的固体颗粒为固 定相，装在色谱柱中，以水或含水溶剂为流动相。 由于不同离子与同一树脂交换能力不同，移动速度也不同， 在柱上形成色谱带，另选一适当的洗脱剂进行洗脱交换，可将 吸附物质按先后顺序从柱上洗脱下来，即可实现不同组分物质 的分离。
凝胶色谱技术在水溶性化合物分离中的应用

1
前
言
自然中的植物、动物、微生物及其代谢产物中的多数有机化合物是天然 药物、天然食品添加剂和化妆品的重要原料。
由干其化学成分复杂，含量有高有低，有含量高而无效的，含量低而有 效的，为研究其中的有效成分，须将这些有效成分从中提取出来得到单体。
天然产物很多成分的性质很相似，有效成分的提取、分离十分不易。如 分离不完全，将含量少的有效成分丢失，或提取到一些无效化合物。
2.4 凝胶色谱

(1)葡聚糖凝胶：商品型号即按交联度大小分类，并以吸水量多 少表示。Sephadex G-25，G为凝胶(Gel)，G-25示此葡聚糖凝胶 吸水量为2.5 mL／g Sephadex G型仅适合于在水中应用，且不同规格适合分离不 同相对分子质量的物质。


(2)羟丙基葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)：是SephadexG-25经羟丙 基化处理后得到的产物，葡聚糖凝胶分子中的葡萄糖部分与羟 丙基结合成醚键。 SephadexLH-20除具有分子筛特性外，在混合溶剂中常常起到反 相分配层析的效果，在天然产物分离纯化方面得到了越来越广 泛的应用。
正相液相色谱及反相液相色谱均可用于分析原花青素，二者各有特点， 正相液相色谱法主要按原花青素分子量(聚合度)的不同将其分离，基本上按 聚合度由低到高先后出峰，对甚至可以检测七聚体，但不能区分同聚体中 各异构体。 反相色谱则可以较好地分离单体及二、三聚体的某些异构体，但随着聚 合度的增加，各聚合度化合物重叠而无法分离。


3.3 ODS系列

ODS系列是由硅胶上引入十八碳的长链烷基而形成的。

作为一种由HPLC分析用层析担体转化而来的分离用层析担体，它的应用较 为成熟，对不同极性化合物的反相吸附及反相分配作用是它分离的基础。
缺点，烷基容易脱落污染分离物，因此一般最多只能用80％甲醇-水冼脱。 ODS的型号很多，如BondapakCl8/Porasil B，Prep-PAK500／Cl8，Fuji-gel ODS-G3等，不同品牌的ODS由于制作工艺不同,烷基化程度也不同,在性能 上存在很大差别。 还有一些类似于ODS的层析担体如LC-sorb SP-BDPH，它是在硅胶上引入联 苯基表现出了一定的反相吸附能力。

2.1 吸附柱色谱
利用吸附剂对各组分吸附能力不同，用洗脱剂洗脱时，吸附 力不同的组分流出顺序不同。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝。 1 聚酰胺吸附层析法
通过分子中的酰胺羰基与酚羟基，或酰胺键上胺基与羰基形成氢键缔合 而产生吸附。吸附强弱则取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。 聚酰胺特别适合于酚类、黄酮类化合物的制备分离。 对鞣质的吸附特强，近乎不可逆。
3 各种色谱材料在水溶性成分分离中的应用

根据溶解性，把植物的化学成分分为水溶性和脂溶性两大类
在我国长期以来，由于条件的限制和方法的不成熟，对天然 植物化学成分的研究仅仅局限于脂溶性成分。
也曾对水溶性成分进行过研究，应用经典的植化方法对水溶 性成分的研究，易导致衍生物的产生，也会出现随着分离精制的 深入生理活性逐渐消失，活性成分被错定等问题。 我国传统中草药以水煎为主，其活性成分以水溶性居多，因 此系统地研究植物水溶性成分进一步深入发掘我国天然植物资源 这个宝库、给植物的活性成分做一个准确的定论以及进一步完善 植物化学这个学科都有着较为重要的现实意义。
鉴于此我们开展了植物水溶性成分研究这个领域，以寻求和 开辟一条植物水溶性成份分离研究的新途径。

4 实例1：葡萄籽原花青素的分离

葡萄籽原花青素主要由(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素及其二聚、三聚、四 聚……最高平均聚合度达十八聚体组成。

各单体之间主要通过4→6或4→8键相连，以二聚体为例有18种可能的异 构体，结构非常复杂。而且各低聚体及各同聚异构体之间极性相近，一般 较难分离分析。

近年来层析理论和层析担体的不断更新和完善使得分离更趋有效，尤其 是反相层析担体研究的出现，给植物水溶性成分的研究带来了一线生机。

反相层析担体具有温和的处理条件和几乎100％的回收率，较好地克服 了传统方法的弊端，显示出强大活力。反相层析担体种类繁多，不同的层 析担体显示了不同的层析作用，同时具有着各自的缺陷。
2.3 分配柱色谱
分离极性较大的水溶性成分如糖苷时，采用正相层析效果 不好，反相层析，适合于水溶性成分的分离。 常用反相柱层析的填料，系将普通正相硅胶亲水性表面经 化学修饰，键合上长度不同的烃基形成亲油性表面而得。
根据所健合的乙基(-C2H5)、辛基(-C8H17)或十八烷基(- C18H37) 等烃基，分别命名为反相硅胶RP-2、RP-8、RP-18。 近年来中低压液相柱层析装置及Lobar柱因分离规模较大、 效果好、速度快，加之价格比较便宜、操作简便等广泛应用。