实验六_植物原生质体分离及融合综述
植物原生质体的分离及融合
植物原生质体的分离及融合生93沈睿2009012372同组：古梦婷实验日期：2011年11月2日一．实验原理1.原生质体分离原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。
细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。
2.原生质体融和诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。
本实验用PEG诱导原生质体融和。
PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。
PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。
当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。
Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。
高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。
普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。
PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。
二．实验步骤1.原生质体的制备（1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。
（2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。
（3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。
（4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。
植物原生质体培养及细胞融合总结
龙胆试管苗的叶片只有用4℃低温处理后，分离得到的原生质体才能分裂。
（在很多情况下材料不必经过专门的预处理）
（二）原生质体分离方法
1. 机械法
Klercker 于1892年最早进行分离高等植物原生质体的研究。
其方法是把细胞置于一种高渗的糖溶液中，使细胞发生质壁分离， 原生质体收缩成球形，然后用利刃切割，
1968年， 纤维素酶和离析酶 商品化生产 后， 大量进行植物原生质体的研究。
现在
果胶酶处理 → 单细胞－－纤维素酶处理 → 原生质体
分离原生质体 最有效方法。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶 C ，作用于天然 的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、 果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
Piwowarczyk （1978 ）改进了上述方法 两液相 下层：培养基，含 500mM/L 蔗糖 中层：培养基，含 140mM/L 蔗糖，360mM/L 山梨醇 上层：含原生质体酶液，含 300mM/L 山梨醇 和100mM/L CaCl 2
现在用不同连续梯度 Ficoll （聚蔗糖）溶液 ， 上面为酶 -原生质体混合液， 经离心（ 150g ，5min ）, 不同比重的原生质体漂浮在不同浓度梯度的界面上。
缺点
原生质体易受热伤害，易破碎。
五、低密度培养
与细胞培养相似， 原生质体初始植板密度对植板效率有显著的影响。
原生质体培养的一般密度为 104-105。
植物原生质体的分离与融合
实验六植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。
二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。
普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。
该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。
三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、酶解：将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在适宜温度条件下，避光酶解数小时。
2、过滤：用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。
3、原生质体收集：在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。
红辣椒800转/分离心5分钟。
4、洗涤：弃上清液，留沉淀约1ml，加入4ml13%CPW洗液，相同条件下再离心，弃上清液。
弃上清液，留沉淀约1ml，混匀呈悬浮备用。
5、纯化：**蔗糖漂浮法去除碎片法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。
或者（1*）换一洁净离心管加入20%蔗糖溶液约3ml，然后小心将原生质体悬液平铺于离心管表面。
（以上任一方法皆能看到明显界面）(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中。
注意下步镜检决定是否需要:加入3～4ml13%CPW洗液离心，离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。
Ⅱ细胞融合1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。
8原生质体的分离、培养和融合
③几乎可以从任何组织（只要细胞还没有木质化）分离 出原生质体。
现在为常规方法。
二、酶解法的材料来源
1、叶肉细胞 取材方便，供应及时，细胞排列疏松，易于酶解液的处 理，有叶绿素标记。 温室生长的植物，叶片干净幼嫩，是较好的材料来源。
无菌苗的叶片更具优势。
2、悬浮培养的细胞或愈伤组织
由禾本科的植物叶片获得适于培养的原生质体是相当 困难的，可以利用培养细胞制备原生质体。
增加膜的透性。 以盐类调节培养基的渗透压对原生质体往往是有害的。
2. 酶解 材料→ 撕掉下表皮→ -修剪成2cm见方小块 → 置于6cm 直径培养皿中(下表面朝下0.5g) → 加2ml酶解液→置于 25-27°C下保持3-4小时左右--轻轻震荡—原生质体释出。 3、影响酶活性和酶解效果的因素 纯度：纯化的酶活性可能降低 PH值：4.7-6.0之间 温度：酶活性的最适温度40-50℃，植物所需温度为25-30 ℃ 时间：30分钟-20小时 用量：1g鲜组织用10ml酶解液的效果很好。
A：6%的聚蔗糖和9%的聚蔗糖（溶于其他盐类和7%山梨醇 中），组成梯度离心液，经150g离心5分钟。细胞残片留于 管底，原生质体上浮。
B：400g5分钟离心，在蔗糖层之上出现纯净的原 生质体层，碎屑在管底。
原生质体悬浮液，
300mmol/L山梨醇+ 100mmol/LCaCl2
140mmol/L蔗糖+ 140mmol/L山梨醇
第四节 植物原生质体融合
诱导不同来源的原生质体发生原生质体融合，是获得体细胞 杂种的唯一途径
一、体细胞杂种植物
1、科间（融合）杂种 融合产物可以进行细胞分裂，但亲本之一的染色体会选择性 地消失。 2、属间（融合）杂种
ch02植物原生质体的分离、融合及培养
原生质体培养是将植物的体细胞 原生质体培养是将植物的体细胞 二倍体细胞） （二倍体细胞）经过纤维素酶等处理后 去掉细胞壁， 去掉细胞壁，获得的原生质体在无菌培 养基上生长、分裂，最终长成植株。 养基上生长、分裂，最终长成植株。
原生质体培养植物 最有意义的应用在哪里？ 最有意义的应用在哪里？
通常这种方法可将不同植物的原生质体融 合后获得体细胞杂交的植株 获得体细胞杂交的植株。 合后获得体细胞杂交的植株。
Chapter 2 植物原生质体的分离、 培养及融合
1. 原生质体的概念 植物细胞与动物细胞相比具有一 层细胞壁， 层细胞壁，当将细胞壁除去后就可以得到 裸露的球形细胞，称之为原生质体 原生质体。 裸露的球形细胞，称之为原生质体。
易混淆的概念
☺ 原生质体(protoplast)： 原生质体(protoplast) (protoplast)： 指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露 细胞。 细胞。 ☺ 亚原生质体(subprotoplast)： 亚原生质体(subprotoplast) (subprotoplast)： 在原生质体分离过程中， 在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断 裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。 裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它 可以具有细胞核或没有细胞核。 可以具有细胞核或没有细胞核。 ☺ 核质体(nuclearplast)： 核质体(nuclearplast) (nuclearplast)： 由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质 也称为微小原生质体(miniprotoplast) (miniprotoplast)。 体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。 ☺ 胞质体（cytoplast）： 胞质体（cytoplast）： 不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
实验六_植物原生质体分离及融合
原生质融合
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与 水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当 PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使 之粘连。 PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团
原生质体融合的作用：
(1) 可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性 杂交配子不亲合性； (2) 可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种， 且获得的遗传变异范围极广； (3)一次操作可实现两个以上亲本的融合作用 (4) 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； (5) 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；
5.沉淀中加入0.16M氯化钙溶液1—2ml于沉淀， 轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离 心管底部轻轻地加入6—8ml 22%蔗糖溶液， 使之形成界面。 6.静置待原生质体形成一条带时弃去上、下 液及残渣，用吸管收集原生质体。 7.用.0.24M 氯化钙溶液洗涤一次，离心吸取 上清液。 8.沉淀中加入1—2ml.0.16M氯化钙溶液悬于 沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密 度为200000个/ml。
实验六
植物原生质体分离及融合
实验目的
了解植物原生质体分离、融合基本原理。
掌握植物原生质体分离、融合基本过程。
实验原理
植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的 意义，它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成 为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸
植物原生质体的分离与融合
实验的意义
植物原生质体分离、融合及培养在理论和实践上都 有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔 的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之 一，不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传 统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，使有性不亲 和的植物种间可以通过原生质体融合产生杂种细胞，为 部分的有性不亲和性开辟了道路。因此，原生质体融合 技术可望成为作物改良的有力工具之一。
实验结果
菠菜和红番茄原生质体融合结果
实验结果
黄番茄和红番茄原生质体融合结果
实验结果
菠菜和黄番茄原生质体融合结果
实验结果
我们发现实验所期望的异源二倍融合细 胞所占的比例并不大，而相应较多地是未融 合的单个细胞和细胞碎片，由此可见原生质 体融合的效率并不是很高。
实验分析
从实验结果中可以看出，原生质体融合的效率并不很 高，去细胞壁后为原生质所包围的“裸 露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离 原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由 纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半 纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
原生质体融合是由于原生质体无壁，所以能超越细胞 间的不亲和障碍，便于进行各种远缘种间细胞杂交，可通 过融合等技术将外源遗传物导入培育新品种，为部分的有 性不亲和性开辟了道路。
参考文献
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植物原生质体融合
植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。
它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
原生质体的分离分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。
采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。
酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。
每克材料用酶液10～30ml不等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。
例如，游离小麦是浮细胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol/L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加0．4～0．45mol／L的甘露醇，两者差别较大。
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。
去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。
如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。
对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。
对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。
酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。
但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。
酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。
综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养
综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义,在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。
它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。
1954年，植物单细胞培养才获得成功。
Mllir培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；I960年Jones等建立了微室培养法。
同年，Cocking 应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。
随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。
实验目的了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞。
是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。
高Ca高pH法和电融合法：PEG作为一种高分子化合物，20〜50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗.使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醛键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可昨为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
第十一章 原生质体的分离和融合
第二节 原生质体融合
(4) 异核体培养24 异核体培养24 小时后发生第一次 细胞分裂，培养48 细胞分裂，培养48 小时后发生第二、 三次细胞分裂。
第二节 原生质体融合
(5) 异核体培养4天后长 异核体培养4 成小细胞团。 移至培养基（MS+KT 移至培养基（MS+KT 3mg/L，2.4- 0.2mg/L） 3mg/L，2.4-D 0.2mg/L） 上培养。 一周后移至分化培养基 （MS+6BA 3mg/L+NAA 0.1mg/L）上培养，诱导 0.1mg/L）上培养，诱导 出胚状芽尖。
第二节 原生质体融合
(2) 将二种原生质体悬 液混合后置接通电源的 电极小室内，加12/MHZ、 电极小室内，加12/MHZ、 150VPP/cm正弦交变电 150VPP/cm正弦交变电 场后，原生质体排列成 串。
第二节 原生质体融合
(3) 加50us，0.550us，0.52.0kv/cm高压脉冲 2.0kv/cm高压脉冲 三次后，开始融合， 于10分钟后完成圆 10分钟后完成圆 化过程。
在酶液消化过程中， 由于实验材料的个体 差异，酶解时间不固 定。因此要用显微镜 随时检查酶解情况。
第十一章 原生质体的分离和融合
（2）培养条件： pH4.7-6.0(利于酶活性), pH4.7-6.0(利于酶活性), 温度25-30℃,30温度25-30℃,30-20h （3）渗压剂：防止处理过程吸涨 ）渗压剂：防止处理过程吸涨 “轻微高渗”比低渗溶液稳定。 轻微高渗” 山梨醇
②悬浮培养的细胞：禾本科的植物
第十一章 原生质体的分离和融合
2．前处理： ①消毒： ②撕去叶下表皮，或 把叶片切小块。 目的使叶肉细胞充 分接能到酶液。
原生质体的分离与融合
02
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诱导原生质体融合
03
杂种植株的再生与鉴定
选择融合体或杂种细胞
(一) 原生质体融合
原生质体融合（Protoplast fusion）是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。 自然融合（Spontaneous fusion） 来源于分裂旺盛细胞的原生质体，自发融合的频率较高。小孢子来源的原生质体融合率可高达50~70%。实际上自然条件下受精就是一种自发融合。
2.酶法
原生质体的分离
01
二、影响原生质体分离的因素
01
原生质体分离时主要考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透
02
压、酶解时间、温度等。
03
组织和细胞材料的生理状态
04
植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体
05
的最方便、最合适的植物材料。叶肉细胞排列松散，酶试剂很
06
容易达到细胞壁。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应
添加标题
质杂种。
体细胞杂交
物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型。
01
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01
体细胞杂种的应用
一、体细胞杂种的应用潜力
添加标题
植物育种中的核质替换
添加标题
细胞质杂种的获得
添加标题
远缘杂交创造新物种
实验六原生质体的分离与融合（2012）
实验六植物原生质体的分离与融合第一部分：综合性实验紫叶甘蓝与园葱原生质体的分离与融合一、实验原理及意义植物原生质体由于已去除了细胞壁，它能够像动物细胞一样，在人为的条件下互相融合，获得细胞杂种植株。
如果用近缘种内或种间的原生质体融合，可以获得稳定的、具有双亲两套染色体的细胞杂种植株，它们往往可育，可以直接作为育种的种质材料；如果用远缘不亲和物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不到的无性杂种植株，不仅克服了远缘杂交不亲和性，而且可以扩大植物的变异范围，拓宽种质来源，选育出新种质，甚至产生新种。
要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。
目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。
1.酶：分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。
2.渗透稳定剂：植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。
去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。
因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同。
3.植物材料：一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。
但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。
材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。
4.酶溶液的pH值：对原生质体的产量和生活力影响很大。
一般为5~7。
酶的活性与pH值有关。
Onoznka纤维素酶R－10最适宜pH值为5~6。
不过实际上酶溶液的pH值经常调节4.7~6.0之间。
对于不同的材料、不同型号的酶其所要求的最适值是不同的，应通过实验确定。
5.温度：对酶解效率和植物原生质体的活力都有影响。
酶：40~50摄氏度，适于植物材料的温度一般都在25℃，所以一般在25℃左右进行酶解。
二、试剂的配制1、pH5.7的磷酸钾缓冲液10 mL：A液：称取0.272g KH2PO4（0.2mol/L，溶于蒸馏水中，定容至10 mL。
植物原生质体的分离与培养
过滤：酶液配制后需以0.45 μm微孔膜过滤除菌，而不可采 用加热灭菌法
酶解分离
方法： 一步法是将材料在2l一28℃用纤维素酶及果胶酶混合液一次性处理 2—24h。 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再用纤维素酶 脱壁而释放原生质体
培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的 渗透压以利于其进一步的生长和发育。这种方法由于改善了 培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细 胞团的形成。
3 植板密度与培养条件
植板密度：
对原生质体培养是否成功影响很大，过高或过低都不利于培养成功 密度（细胞计数法确定）：
Cell wall regenerated in the first 48 h of protoplast culture.
Yang X et al. J. Exp. Bot. 2008;59:3661-3674
细胞分裂和生长
一般原生质体培养2～7d后开始第一次分裂，但开始第一次 分裂的时间随植物的种类、分离原生质体的材料、原生质体 的质量、培养基的成分和培养条件而异。
优点：
可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体 分裂频率。
缺点：
操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏 高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生 质体不易混合均匀。
琼脂糖珠培养
将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50 μl一 滴的量滴于直径6 cm的培养皿，待其固化后向其中添加3 ml 液体培养基并于摇床上低速旋转培养。
原生质体分离与融合
原生质体的分离、融合与培养一、实验目的1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。
2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。
3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。
二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
三、实验材料、试剂与仪器1．材料新鲜的菠菜叶片2．试剂（1）酶液：依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸（MES），55℃水浴10min，冷却至室温，再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA，0.45um微孔滤膜过滤，溶液呈透明橙色。
（2）PEG溶液：4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。
（3）MMg溶液：0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。
--细胞生物学原生质体的分离与融合综合性实验报告
细胞生物学综合性实验课程名称: 细胞生物学实验姓名:班级:学号:时间: 年月日植物原生质体的分离、纯化及融合1 材料、试剂与方法1.1材料菠菜叶片,唐古特白刺愈伤组织,金盏菊花瓣。
1.2 试剂5%次氯酸钠,无菌水,酶液A,0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液,20%蔗糖溶液，0.16 mol/L的Cacl2.2H2O溶液，酶液B,12%蔗糖溶液，PEG溶液，高PH高钙稀释液。
1.3方法1.3.1菠菜叶片和金盏菊花瓣的消毒处理称取金盏菊花瓣1.5g或菠菜叶1g,用自来水冲洗;分别用5%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，再用无菌水洗4次。
1.3.2 原生质体的分离1.将消毒后的金盏菊花瓣用镊子撕成细丝。
2.酶解：加5ml酶液A,封口，保持28℃,3-6小时。
3.过滤及离心：600r/min离心5min,弃去上清液保留沉淀。
1.3.3 原生质体的纯化1.将沉淀用2ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。
2.用注射器缓缓向离心管底部6ml 20%蔗糖溶液,600r/min离心5min,得到原生质带。
3.用注射器吸出管底杂质和蔗糖及上部Cacl2.2H2O溶液。
4.留下的原生质带用5ml 0.2mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮, 600r/min离心5min。
5.用3ml 0.16mol/L的Cacl2.2H2O溶液悬浮。
1.3.4 原生质体的融合1.将菠菜叶和金盏菊的原生质体悬液等量混合。
2.用吸管将混合的原生质体混合液滴在培养皿中，7-8滴每皿，静置10min,使其贴壁。
3.用吸管将等量的PEG溶液滴在原生质液滴上，静置10-15min 观察细胞的粘连。
4.用刻度吸管向原生质液滴慢慢加入高PH高钙稀释液。
第一次0.5ml,第二次1ml，第三四次各2ml,每次间隔5min。
5.平皿微倾斜，吸取上清液，缓缓加入4ml高PH高钙稀释液,静置5min后弃去上清液。
6.加入MS培养基4ml, 静置5min后弃去上清液。
苜蓿原生质体分离与体细胞融合条件的研究
苜蓿原生质体分离与体细胞融合条件的研究苜蓿（Medicago sativa）是一种重要的牧草植物，广泛应用于畜牧业和土壤改良。
为了进一步提高苜蓿的品质和产量，研究人员一直致力于开展基因编辑和转基因改良的研究。
然而，在进行遗传改良之前，第一步是需要成功地获得苜蓿的原生质体，以及实现体细胞融合。
本文将探讨苜蓿原生质体的分离方法以及体细胞融合的条件研究。
首先，苜蓿原生质体的分离是进行体细胞融合的重要步骤之一。
常规的方法是通过组织培养技术来获得苜蓿的原生质体。
首先，选择苜蓿幼苗的茎、叶或芽作为外植体，表面消毒后切割成小段。
然后，使用无菌条件下的液体培养基，添加适量的激素（如植物生长素和植物激素），并将外植体培养在培养基中。
经过适当的处理和培养时间后，原生质体会从外植体的细胞中分离出来。
这些原生质体可以进一步用于体细胞融合的实验。
其次，体细胞融合是利用不同细胞的融合来获得新的遗传特征。
在苜蓿中，常见的融合方法是利用聚合醇（如聚乙二醇）诱导细胞融合。
首先，需要将获得的原生质体分散在适当的培养基中，并与另一种相关物种的原生质体混合。
然后，将聚乙二醇加入培养基中，通过电脑系统控制融合条件，使得两种细胞融合成功。
接下来，将混合样品进行适当的处理，以分离和筛选出融合细胞。
这些融合细胞具有双倍体的特征，并且存在着不同物种间的基因交流，可以用于进一步的遗传改良研究。
然而，在进行苜蓿原生质体的分离和体细胞融合之前，需要对条件进行一系列的优化研究。
例如，培养基的成分和激素浓度对原生质体分离和融合的效果有重要影响。
研究人员通常通过不同浓度和组合的激素来测试其对原生质体和融合细胞的影响，并选择最适宜的条件。
此外，温度、光照和pH值等环境因素也需要进行优化，以提高原生质体的分离率和细胞融合的成功率。
除了条件的优化，不同苜蓿品种之间可能存在差异，也需要进行基因型和环境交互作用的研究。
不同品种之间的差异可能导致原生质体分离和体细胞融合的效果不同。
植物原生质体分离
四、实验方法Biblioteka （一）原生质体的分离收集： 1. 去菠菜叶片撕去下表皮，每组织称0.2g， 切成小块放到10ml酶液中，在26℃下酶解 4-5小时，或酶含量减半过夜，期间轻轻摇 动几次。 2. 用100目的过滤筛过滤。 3. 用于滤液等体积的0.16M CaCl2· 2O溶 2H 液冲洗过滤筛，使冲洗液冲入过滤液。
实验九
植物原生质体分离及融 合
一、实验目的
• 学习植物原生质体的分离及融合的原理， 掌握其操作方法。
二、实验原理
• 植物原生质体是具有质膜，但去掉了细胞 壁的植物细胞，分离的原生质体在培养条 件下具有再生新壁，进行连续的细胞分裂， 并分化成完整植株的能力，即具有细胞全 能性。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶 质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即 可分解，从而脱去细胞壁。由于质膜完全 暴露，原生质体具有摄取大分子，细胞器 和细菌，病毒的能力，因此是进行遗传操 作，基因转移的好材料。而原生质
• 体融合是实现上述目的的一个极为重要的 手段。同种或异种原生质体可在聚乙二醇 诱导下产生异核体，实现体细胞杂交，创 造新的生物类型。
三、实验用品
• （一）材料：菠菜叶片； • （二）用具：倒置显微镜、离心机、过滤 筛（100目）、漏斗、烧杯、吸管、长注射 针、注射器（5-10ml）等； • （三）试剂： • 1.纤维素酶2%、果胶酶1%； • 在0.65M甘露醇、0.05MCaCl2· 2O和 2H 0.1%MES中，PH调至5.6-6.0；
• • • • •
2. 0.16 MCaCl2· 2O溶液PH5.6； 2H 3. 22%蔗糖溶液； 4. 30%聚乙二醇（PEG）溶液； 5. 高PH高钙洗脱液 0.1M CaCl2· 2O 、0.1M梨酶醇、 2H 0.5ml/100ml 1MTris • 6. 0.24M CaCl2· 2O 2H
原生质体分离实验总结
植物花瓣原生质体分离实验总结
一．探究甘露醇浓度对原生质体分离效果的影响
1.设置甘露醇浓度梯度：5% 6% 7% 8% 9%
2.酶浓度：1.25%纤维素酶+0.5%果胶酶
3.试材：牵牛花瓣
4.酶解时间：三小时
5.结果：5%，7%甘露醇浓度下得到较少原生质体，8%，9%甘露醇浓度下原生
质体开始发生破裂，6%时得到较多原生质体
5% 6%
8% 9%
6.结论：6%为分离植物花瓣较适合的原生质体浓度
7.其他：本次实验中试采用20%蔗糖溶液进行蔗糖漂浮法但未成功二．探究不同酶浓度对不同花瓣原生质体分离效果的影响
1.酶浓度：（甘露醇浓度为6%）
低浓度：1.25%纤维素酶+0.75%果胶酶
中浓度：1.5%纤维素酶+1%果胶酶
高浓度：2%纤维素酶+1.25%果胶酶
2.试材：紫色鸢尾粉色牵牛红色长寿花
3.酶解时间：三小时
4其他：使用20%蔗糖溶液进行蔗糖漂浮，在3000转/min下离心1min，明显在离心后的上下界面交界处得到漂浮的有色原生质体
5.结果：鸢尾花在低浓度下得到的原生质体质量较好，在高浓度下得到的原
生质体数量明显较多，但在中高浓度下开始出现破裂
低浓度
中浓度
高浓度
牵牛花在各浓度下得到的原生质体数量区别不甚明显，但在中浓度
下得到的质量较好
（没有照到特别清楚的图）
长寿花没有被很好地酶解，在各浓度下得到的原生质体都很少
6.结论：鸢尾花的最适酶浓度为低浓度
牵牛花的最适酶浓度为中浓度
本实验中未得到合适的长寿花酶解浓度。
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半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和
果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
原生质融合
外界因素作用下，两个或两 个以上植物细胞合并成一个多核细 胞的过程称为植物细胞融合，或植 物体细胞杂交。
原生质融合
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融
合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚
双荧光素标记
实验方法
（一）原生质体的分离收集
1.取菠菜叶片撕去下表皮，称0.2g,切成小块 放到10ml酶液中，在26℃下酶解4—5小时， 或含酶量减半过夜，期间轻轻摇动几次。 2．用100目的过滤筛过滤。 3.用与滤液等体积的0.16M氯化钙溶液冲洗过 滤筛，使冲洗液冲入过滤液。 4.滤液用离心机100—300rpm，离心5分钟， 弃上清液。
原生质体融合的作用：
(1) 可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性 杂交配子不亲合性； (2) 可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种， 且获得的遗传变异范围极广； (3)一次操作可实现两个以上亲本的融合作用 (4) 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； (5) 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；
实验六
植物原生质体分离及融合
实验目的
了解植物原生质体分离、融合基本原理。 掌握植物原生质体分离、融合基本过程。
实验原理
植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意 义，它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，可望成为 作物改良的有力工具之一。
植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露
细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生 质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、
5.沉淀中加入0.16M氯化钙溶液1—2ml于沉淀， 轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离 心管底部轻轻地加入6—8ml 22%蔗糖溶液， 使之形成界面。 6.静置待原生质体形成一条带时弃去上、下 液及残渣，用吸管收集原生质体。 7.用.0.24M 氯化钙溶液洗涤一次，离心吸取 上清液。 8.沉淀中加入1—2ml.0.16M氯化钙溶液悬于 沉淀，用血球计数板计数，使原生质体密 度为200000个/ml。
原
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PEG法 原 生 质 体 的 融 合 图 示
图一烟草叶肉细胞和洋葱根尖 细 胞 原 生 质 体 融 合 （ 40× ）
图二烟草叶肉和洋葱根尖细 胞原生质体的异源融合
和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原
生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再 分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的
流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对
融合也可能起作用。
实验用品
材料： 植物叶片（菠菜叶片） 用具： 倒置显微镜，离心机，过滤筛（100目）， 漏斗，烧杯，吸管，长注射针，注射器 （5—10ml）等。 试剂： 1.纤维素酶2% ，果胶酶1% （在0.65M甘露醇，0.05M氯化钙和 0.1%MES中，pH调至5.6—6.0）
9.取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体 的纯度和完整性，也可用荧光显微镜检查。
（二）原生质体融合操作
1.取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻 片上，静置10分钟，使原生质体沉淀在载 玻片上。 2.在两滴悬液之间加一滴30%聚乙二醇（PEG） 溶液，使3滴溶液相连，室温下（15℃— 20℃）。作用5—10分钟，在显微镜下观察 原生质体粘连情况。
乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法： 我们本次试验主要用的是聚乙二醇法。 PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能 对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收 缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗．使原生质体 融合得以完成。
原生质融合
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与 水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当 PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使 之粘连。 PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极基团
2. 0.16M氯化钙溶液（内含 0.1%MES）Ph5.6。 3. 22%蔗糖溶液 4. 30%聚乙二醇（PEG）溶液 5. 高pH高钙洗脱液（Ph=9） 0.1M氯化钙 0.1M梨酶醇 0.5ml/100ml 1M Tris 6. 0.24M 氯化钙
纯化后的叶肉原生质体
原生质体融合
P E G 法