真菌感染的常规检验方法

真菌感染的常规检验方法

真菌的临床实验室检查一般包括标本采集、直接镜检、染色镜检、分离培养、生化反应

及免疫学试验等。以直接镜检和分离培养最重要。

1标本采集

不同真菌感染应采用不同的临床标本。浅部真菌感染可以采集毛发、皮屑、指(趾)甲、

痂等，标本在分离前常先用75％的乙醇消毒。深部真菌感染的检查可取痰、尿液、口腔或阴

道分泌物、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。采集标本时应注意无菌操作。采集标本后应

及时转运至实验室进行检查，一般不超过1～2h，以免标本变质污染。标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。

2检查方法

2.1 直接检查法直接镜检是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。其优点在于简便、

快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。但是，除了少数真菌外，多数不能确定其

种类。由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断，有时需反复检查或做其他方法检查以进

一步确定。直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。

2.1.1 不染色标本检查取皮屑、毛发、指(趾)甲屑等标本置于载玻片中央，滴加100～

200g／L KOH溶液1～2滴，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加热，使组织或角质溶解、透明后，先于低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查其特征，可初步诊断真菌感染。

2.1.2 染色标本检查有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地观察，常用的染色方

法如下。

(1)革兰染色法：多用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌等。所有真菌

均为革兰阳性。

(2)乳酸酚棉蓝染色法：取标本于载玻片上，滴加染液，加上盖玻片后于镜下观察，真菌

被染成蓝色。该法适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。

(3)荧光染色法：用0.1％吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆

菌为红黄色，曲霉菌为绿色。

2.2 分离培养法

真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。其培养方法有多种，根据需要选用最适合的方法。

2.2.1 培养基在不同的培养基上真菌菌落形态变化很大，一般以沙保弱(SDA)培养基为基

准描写菌落的形态。常用的培养基有无选择性培养基(如沙保弱培养基、牛脑心浸液培养基和

血琼脂培养基)、选择性培养基(如放线菌酮－氯霉素琼脂)和鉴别培养基(如马铃薯葡萄糖琼脂、酵母浸膏琼脂、米粉琼脂)。

2.2.2 培养方法

(1)平皿培养法：培养基倾注于平皿，然后将皮屑、甲屑、毛发标本经70％乙醇浸泡2～

3 min以杀死杂菌，无菌盐水洗净后接种于沙保弱培养基上，置25～28℃培养数日至数周，

观察菌落特征；其他标本接种于血平板或沙保弱培养基上37℃培养。此法的优点是便于分离

并观察菌落特征，但水分易蒸发。

(2)试管培养法：实验室中最常用的一种方法，一般用于菌种传代接种与保存。在大口径试管中装入培养基，制成斜面。接种方便、不易污染。

(3)小培养法：观察真菌结构特征及生长发育全过程的有效方法。小培养法有多种多样，本节介绍玻片培养法：①取无菌“V”形玻棒(或浸泡乙醇，干后)放入无菌平皿内；②取无菌

载玻片(或浸泡乙醇，干后)放在玻棒上；③制备1cm2马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)于载玻片上；

④在琼脂块的每一侧用接种针接种待检菌。

2.3 真菌的鉴定

2.3.1 生化反应鉴定

(1)糖(醇)类发酵试验：检验真菌最常用的生化试验。所用的糖有葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、密三糖、淀粉等；醇类有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇等。

(2)同化碳源试验：检验真菌对糖类中的碳源利用能力的一种很有价值的试验。主要用于鉴定酵母菌。其原理是某些真菌在不含碳源而仅含氮源的合成固体培养基上不生长。当培养

基中加入该菌能利用的糖类物质时，则该菌生长。一般对双糖类发酵的真菌，都能同化或利

用糖类或碳源。方法是含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45℃)混合，然后在培

养基上分别加糖或浸糖干燥滤纸片，置于25℃或37℃孵育24 h观察结果。如能同化，则在

糖或含糖纸片周围有生长圈，否则无生长。

(3)同化氮源试验：与同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾，观察真菌对硝酸钾的利用情况。多用于酵母菌的鉴定。

2.3.2 免疫学检查真菌感染的诊断，主要取决于病原学诊断。但在某些情况不能获得病

原学证据，如急性组织胞浆菌病、曲霉型支气管炎等，需要依靠免疫学手段进行辅助诊断。

近年来产生了较多免疫学方法对深部感染的真菌进行检测，以作为荚膜组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌感染的辅助诊断。但系统性感染患者常因免疫功能降低不出现抗体，而且许多真菌之

间抗原性有交叉反应，有的产生抗体后维护时间较长，正常人群中有一定比例的阳性率。

参考文献

[1]张秀珍.当代细菌检验与临床[M].北京:人民卫生出版社，1999，257～272.

[2]叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程[M].第2版，南京:东南大学出版社，1997，151.