感受态制备、蓝白斑筛选

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制备感受态细胞和转化的常用方法
CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到 5106－2107转化子/g质粒DNA，简单、快速、 重复性好、菌株适用范围广。
电穿孔转化法、脂质体(liposome)法、胞核的显微 注射法(microinjection)；
磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；
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α
U6
互
补
的
检
测
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目录
原 位 杂 交
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目录
Southern印迹
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目录
鸡的β肌球蛋精选白课件的克隆和检出
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目录
预期结果
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pUC119
pUC119 -u6
含空载体 pUC119的蓝
色菌落
含pUC119 -u百度文库 的白色菌落
培养基：Amp＋X-gal
筛选重组体
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基因工程
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一、感受态细胞及重组体转化
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重组体转入受体菌
转化（transformation）
转染（transfection）
受体细胞
转导（transduction）
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重组DNA分子导入受体细胞的手段
转化是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。
转染是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞;
分子医学实验
感受态细胞的制备 质粒转化入大肠杆菌及初步筛选
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▪ 复习：基因克隆示意图
载体DNA ＋
(限制性内切酶切目 开的 ) 基因
＋
宿主细胞
重组体
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
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表达
基因克隆操作过程：
分
分离载体和目的基因
切
限制酶切载体与目的基因
接
拼接重组体
转
转入受体菌
筛
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筛选的依据： 基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。 筛选的方法：
抗药性标志的选择 插入表达筛选 -半乳糖苷酶系统筛选（-互补） (-半乳糖苷酶能将X-gal转变为不溶性的深蓝沉淀）
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(
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
)
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目录
菌落杂交筛选法 内切酶图谱鉴定 PCR筛选重组子 Southern印迹杂交和菌落原位杂交 DNA序列分析 免疫化学检测法
培养基：Amp＋X-gal
▪Thank you！
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细菌转移到一冰冷的1.5ml的EP管，40C，4000rpm×5min
弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 300μl，重悬菌体，冰浴20min 40C，4000rpm×5min
弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净 沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 100μl，重悬菌体。
转导则是指病毒从被感染的细胞(供体)释放出来，再
次感染另一细胞(受体时)，发生供体细胞与受体
细胞之间的DNA转移及基因重组。
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转化方法
• CaCl2诱导转化 • 电穿孔 • PEG介导转化 • 人工体外包装
特殊处理
受体细胞
细胞膜特性 改变
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受体细菌
50-100mmol/L CaCl2
冰浴10min
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冰浴10min后 每管加入质粒5l 轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置20min
试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动试管
迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min
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取出试管后，每管加入LB培养基800l，
置于370C摇床（100~150r/min），温和震荡45min
用无菌弯头玻璃铺菌器将200l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面
室温放置20min，使液体被吸收（发汗）
倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长
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三、重组体的筛选
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重组体克隆的筛选与鉴定
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因 此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组 DNA的阳性克隆。
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蓝白斑实验
原理：基因载体上含有ß-半乳糖苷酶（LacZ)的 基因，当外源DNA插入到载体的LacZ基因上后将 造成ß-半乳糖苷酶失活，就不能分解培养基中的Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-ß-D-半乳糖苷）产生蓝色产物， 结果可通过大肠杆菌转化子菌落在含有X-gal-IPTG （异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷）培养基的颜色变化 直接观察出来。
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0.1mol/LCaCl2
0℃
重组体
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感受态细胞
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转化与感受态细胞
转化(transformation)：在分子克隆技术中，转化特 指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的 过程。 区别转化、转染(transfection)与转导(transduction)
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二、感受态细胞制备及重组体 转化的实验操作及注意事项
感受态细 菌
CaCl2处理
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重组体转入细 菌
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感 受 态 ( competent)： 宿 主 细 胞 处 于 容 易 吸收外源性DNA的状态，处于感受态的细胞 称为感受态细胞.
正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁） 作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中 通过一定的理化条件使细胞通透性增大，处 于感受态。
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CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理
一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低， 难以转化成功。当细菌处于冰冷（0℃）0.05～ 0.1M的 CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球 形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增 强，转化效率提高（感受态细菌）。
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同 时 在 转 化 体 系 中 的 DNA 形 成 的 抗 DNase 的 羟基-钙磷酸复合物能粘附于细菌表面，经过42℃ 短时间热休克（heat shock）处理，促进感受态细 胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长1小时后， 球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在转化 细菌中得到表达，在选择性培养(selective culture) 平板上即可筛选出所需的转化子。